微生物检测，如何保持肠道菌群的健康 宏基因检测（NGS）在病源微生物检测中的应用 健明迪

在产品微生物检测进程中，实验员们会接触到许多不同的微生物种类，小编就来总结下检测实验中常检出的微生物。

大肠菌群

大肠菌群，它不代表某一个或某一属细菌，而指的是具有某些特性的一组与粪便污染有关的细菌。

大肠菌群都是直接或直接地来自人和温血植物的粪便。普通食品中大肠菌群超标，表示食品受动温血植物的粪便污染，其中典型大肠杆菌为粪便近期污染，其他菌属则能够为粪便的新鲜污染。

人吃了大肠菌群超标的食物能够会招致：肠道传染病、食物中毒等。

霉菌

霉菌，是丝状真菌的俗称，意即"发霉的真菌"，它们往往能构成分枝茂盛的菌丝体，但又不像蘑菇那样发生大型的子实体。在湿润暖和的中央，很多物品上长出一些肉眼可见的绒毛状、絮状或蛛网状的菌落，那就是霉菌。

霉菌在我们的生活中无处不在，它比拟喜爱于暖和湿润的环境，一有适宜的环境就会少量的繁衍，必需采取措施来阻止霉菌的繁衍或切断其传达途径，就可以解脱霉菌的污染。

霉菌毒素对人主要毒性表如今神经和内分泌紊乱、免疫抑制、致癌致畸、肝肾损伤、繁衍阻碍等。

酵母

酵母是一些单细胞真菌，并非系统演化分类的单元。是子囊菌、担子菌等几科单细胞真菌的通称，普通泛指能发酵糖类的各种单细胞真菌，有的为致病菌。

空气中、人体中都存在一定数量的酵母菌，只需在适宜的环境就会快速繁衍;吃了酵母菌污染的食品易形成食物中毒，有些免疫力低的人群亦能够发作酵母菌感染。

金黄色葡萄球菌

金黄色葡萄球菌是人类的一种重要病原菌，附属于葡萄球菌属，有“嗜肉菌"的别称，是革兰氏阳性菌的代表，可惹起许多严重感染。

金黄色葡萄球菌在自然界中无处不在，空气、水、灰尘及人和植物的排泄物中都可找到。因此，食品遭到污染的时机很多。美国疾病控制中心报告，由金黄色葡萄球菌惹起的感染占第二位，仅次于大肠杆菌。

金黄色葡萄球菌是人类化脓感染中*罕见的病原菌，可惹起局部化脓感染，也可惹起肺炎、伪膜性肠炎、心包炎等，甚至败血症、脓毒症等全身感染。

沙门氏菌

沙门氏菌是一种罕见的食源性致病菌。沙门氏菌属有的专对人类致病，有的只对植物致病，也有对人和植物都致病。沙门氏菌病是指由各种类型沙门氏菌所惹起的对人类、牲畜以及野生禽兽不同方式的总称。

感染沙门氏菌的人或带菌者的粪便污染食品，可使人发作食物中毒。据统计在世界各国的种类细菌性食物中毒中，沙门氏菌惹起的食物中毒常列榜首。

沙门氏菌主要污染肉类食品，鱼、禽、奶、蛋类食品也可受此菌污染。沙门氏菌食物中毒全年都可发作，吃了未煮透的病、死牲畜肉或在屠宰后其他环节污染的牲畜肉是惹起沙门氏菌食物中毒的*主要缘由。

由沙门氏菌惹起的食品中毒症状主要有恶心、呕吐、腹痛、头痛、畏寒和腹泻等，还伴有乏力、肌肉酸痛、视觉模糊、中等水平发热、躁动不安和嗜睡，延续时问2～3d，平均致死率为4.1%。

志贺氏菌

志贺氏菌即通称的痢疾杆菌。痢疾贺志贺氏菌是招致典型细菌痢疾的病原菌，在敏感人群中很少数量的集体就可致使病。

志贺氏菌食物中毒是指由志贺氏菌惹起的细菌性食物中毒。惹起食物中毒的志贺氏菌主要是宋内氏志贺菌。主要发作在夏春季，惹起中毒的食品主要是热肉制品等。

志贺氏菌侵入肠粘膜组织并释放内毒素惹起症状。潜伏期普通10-14h。症状为猛烈腹痛、腹泻(水样便，可带血和粘液)、发热、里急后重清楚。严重者出现痉挛和休克。

溶血性链球菌

溶血性链球菌又称沙培林,对热和化学清毒剂均敏感，常惹起扁桃体、咽部、中耳等感染。亦为肾盂肾炎、产褥热、猩红热的病原体。

普通来说，溶血性链球菌常经过以下途径污染食品：

（1）食品加工或销售人员口腔、鼻腔、手、面部有化脓性炎症时形成食品的污染；

（2）食品在加工前就已带菌、奶牛患化脓性乳腺炎或畜禽局部化脓时，其奶和肉尸某些部位污染；

（3）熟食制品因包装不善而使食品遭到污染。

溶血性链球菌常可惹起皮肤、皮下组织的化脓性炎症、呼吸道感染、盛行性咽炎的迸发性盛行以及重生儿败血症、细菌性心内膜炎、猩红热和风干冷、肾小球肾炎等变态反响。

李斯特菌

李斯特菌，又名单核球增多性李斯特菌、李氏菌，是一种兼性厌氧细菌，为李斯特菌症的病原体。李斯特菌是革兰氏阳性菌，属厚壁菌门，取名自约瑟夫?李斯特。它主要以食物为传染媒介，是*致命的食源性病原体之一。

李斯特菌在环境中无处不在，在绝大少数食品中都能找到李斯特菌。肉类、蛋类、禽类、海产品、乳制品、蔬菜等都已被证明是李斯特菌的感染源。

李斯特菌感染后安康成人集体可出现细微相似流感症状，重生儿、孕妇、免疫缺陷患者表现为呼吸急促、呕吐、出血性皮疹、化脓性结膜炎、发热、抽搐、苏醒、自然流产、脑膜炎、败血症直至死亡。

大肠埃希菌

大肠埃希菌是人和植物肠道中的正常栖居菌。大肠埃希菌的致病物质之一是血浆凝结酶。依据致病性的不同，致泻性大肠埃希菌被分为产肠毒素性大肠埃希菌、肠道侵袭性大肠埃希菌、肠道致病性大肠埃希菌、肠集聚性黏附性大肠埃希菌和肠出血性大肠埃希菌5种。

罕见中毒食品为各类熟肉制品、冷荤、牛肉、生牛奶，其次为蛋及蛋制品、乳酪及蔬菜、水果、饮料等食品。中毒缘由主要是受污染的食品食用前未经彻底加热。中毒多发作在3、9月。

不同的致泻性大肠埃希菌惹起的中毒，症状各不相反。

①产肠毒素性大肠埃希菌可惹起水样腹泻、腹痛、恶心、低热。

②肠道侵袭性大肠埃希菌的可惹起发热、猛烈腹痛、水样腹泻、粪便中有大批粘液和血。

③肠道致病性大肠埃希菌可惹起发热、不适、呕吐、腹泻、粪便中有少量粘液但无血，有约20%患者由呼吸道症状，感染的症状通常比拟严重。

④肠集聚性黏附性大肠埃希菌可惹起成年人1-2天中度腹泻，婴幼儿2周以上继续性腹泻。

⑤肠出血性大肠埃希菌可惹起突发性的腹部痉挛、腹泻;有些病人由水样便，转为血性腹泻，腹泻次数有时可达10屡次，低热或不发热;许多病人同时有呼吸道症状。可开展为溶血性尿毒综合征和血栓性血小板增加性紫癜等多器官损害。老人和儿童患者死亡率很高。

副溶血性弧菌

副溶血性弧菌，为革兰氏阴性杆菌，呈弧状、杆状、丝状等多种外形，无牙孢。

进食含有该菌的食物可致食物中毒，也称嗜盐菌食物中毒。临床上以急性起病、腹痛、呕吐、腹泻及水样便为主要症状。副溶血性弧菌是一种陆地细菌，主要来源于鱼、虾、蟹、贝类和海藻等海产品。此菌对酸敏感，在普通食醋中5分钟即可杀死;对热的抵抗力较弱。

肉毒杆菌

肉毒杆菌是一种生长在缺氧环境下的细菌，在罐头食品及密封腌渍食物中具有极强的生活才干，是毒性*强的细菌之一。肉毒杆菌是一种致命病菌，在繁衍进程中分泌肉毒毒素，该种毒素是目前已知的*剧毒物，可抑制胆碱能神经末梢释放乙酰胆碱，招致肌肉松弛型麻木。

肉毒杆菌在自然界散布普遍，土壤中常可检出，偶亦存在于植物粪便中。

人体的胃肠道是一个良好的缺氧环境，适于肉毒杆菌寓居。肉毒杆菌属于厌氧菌，严厉厌氧，在胃肠道内既能分解葡萄糖、麦芽糖及果糖，产酸产气，又能消化分解肉渣，使之变黑，糜烂恶臭。在厌氧环境中，此菌能分泌剧烈的肉毒毒素，能惹起特殊的神经中毒症状，致残率、病死率极高。

摄食肉毒杆菌的食品可引发食物中毒，如pH>4.6的低酸性罐头食品(含铁罐，玻璃罐)或香肠、火腿。人感染肉毒杆菌后会出现视觉模糊、呼吸困难、肌肉乏力等症状，如病情严重能够招致死亡。

霍乱弧菌

霍乱弧菌是人类霍乱的病原体,霍乱是一种新鲜且盛行普遍的烈性传染病之一。曾在世界上惹起屡次大盛行，主要表现为猛烈的呕吐，腹泻，失水，死亡率甚高。属于国际检疫传染病。

人类在自然状况下是霍乱弧菌的独一易感者，传达途径主要是经过污染的水源或未煮熟的食物如海产品、蔬菜经口摄入。寓居拥堵，卫生状况差，特别是公用水源是形成爆发盛行的重要要素。

消费中的控制主要是严厉审核原资料的来源，以及消费工序中的灭菌处置。

变形杆菌

变形杆菌是人和植物的寄生菌和病原菌。普遍散布在自然界中，如土壤、水、渣滓、糜烂无机物及人或植物的肠道内。

可惹起多种感染。中毒食品主要以植物性食品为主，其次为豆制品和凉拌菜，发病时节多在夏、秋，中毒缘由为被污染食品在食用前未彻底加热，变形杆菌食物中毒是我国罕见的食物中毒之一。进食后2~30小时出现上腹部刀绞样痛和急性腹泻，伴有恶心、呕吐、头痛、发热。病程较短，普通1~3天可恢复，很少有死亡。

空肠弯曲菌

空肠弯曲菌菌体轻度弯曲似逗点状，在暗视野镜下观察似飞蝇。有荚膜，不构成芽胞。*适温度为37～42℃。在正常大气或无氧环境中均不能生长。

空肠弯曲菌是多种植物如牛、羊、狗及禽类的正常旅居菌。在它们的生殖道或肠道有少量细菌，故可经过火娩或排泄物污染食物和饮水。人群普遍易感，5岁以下儿童的发病率*，夏春季多见。苍蝇亦起重要的媒介作用。亦可经接触感染。感染的产妇可在分娩时传染给胎儿。

空肠弯曲菌有内毒素能侵袭小肠和大肠粘膜惹起急性肠炎，亦可惹起腹泻的爆发盛行或团体食物中毒。该菌有时可经过肠粘膜入血流惹起败血症和其他脏器感染，如脑膜炎、关节炎、肾盂肾炎等。孕妇感染本菌可招致流产，早产，而且可使重生儿受染。

蜡样芽孢杆菌

芽胞杆菌属中的一种。菌体细胞杆状，末端方，成短或长链，革兰氏阳性。

蜡样芽胞杆菌与少数食物中毒有关(约2–5%)，包括一些严重的恶心、呕吐以及腹痛。

大约来说，杆菌性食物中毒是由于错误地烹调方法形成细菌孢子残留在食物上，更蹩脚的是食物被不当冷冻而让孢子发芽。细菌繁衍的结果是发生肠毒素，人食用含毒素的食物后会发生呕吐、腹泻等不良症状。

耶尔森氏菌

耶尔森菌属于肠杆菌科，包括鼠疫耶氏菌、小肠结肠炎耶氏菌与假结核耶氏菌等十余个菌种，这是一类革兰阴性小杆菌。

其鼠疫耶氏菌、小肠结肠炎耶氏菌与假结核耶氏菌对人类的致病性已明白，其中鼠疫耶氏菌具有F1、V/W、Pgm、Pst1等重要的毒力因子，毒力很强，大批细菌即可使人致病。本属细菌通常先惹起啮齿植物、牲畜和鸟类等植物感染，人类经过接触已感染的植物、食入污染食物或节肢植物叮咬等途径而被感染。

阪崎肠杆菌

阪崎肠杆菌是乳制品中近几年新发现的一种致病菌。阪崎肠杆菌能惹起严重的重生儿脑膜炎、小肠结肠炎和菌血症，死亡率高达50%以上。目前，微生物学家尚不清楚阪崎肠杆菌的污染来源，但许多病例报告标明婴儿配方粉是目前发现的主要感染渠道。

感染性疾病是当今世界严重要挟人类安康的严重疾病。目前，全球感染性疾病的发病率有所上升，病原体出现多样化和复杂化的开展趋向。近年来快速开展的NGS技术因其不依赖于已知核酸序列，无需特殊探针设计，可直接对未知病原微生物停止检测，打破了传统微生物检验的局限性，在临床微生物范围展现了宽广的前景。

感染性疾病简介

感染性疾病多为细菌、病毒和真菌等病原体及其产物所惹起的局部或全身性炎症或器官功用阻碍，具有较大的危害性和较高的病死率。目前，全球感染性疾病的发病率有所上升，病原体出现多样化和复杂化的开展趋向。

重症急性呼吸综合征、新型冠状病毒感染、新变异型克雅病、H7N9 禽流感等新发感染性疾病不时出现。而HIV、多重或广谱耐药的结核分枝杆菌、沙眼支原体等经典感染性疾病病原体又死灰复燃或出现新的致病特征。各种新发和再发的感染性疾病、不易发现的多重感染以及不明病因的发热等，都给人类安康带来了庞大的要挟，因此，临床上对感染性疾病诊断的准确性和时效性提出了更高的要求。

感染性疾病诊断现状

快速、准确的诊断是有效治疗、病情监测和控制疾病蔓延的重要前提。随着分子检测技术的不时开展和完善，分子检测在病原微生物感染诊断及治疗监测上的临床运用日益普遍，已成为一些重要的感染性疾病的诊断和疗效评价中不可缺少的重要工具。目前常用的病原微生物分子检测方法主要包括：基于PCR的电泳法、实时荧光定量PCR（QPCR）、数字PCR、基因芯片技术、测序技术（Sanger测序技术、焦磷酸测序技术、高通量测序技术）等。

在感染性疾病范围中，取得病原体的活体（关于细菌、真菌、病毒而言，主要是培育阳性），是感染性疾病诊断的金规范，但病原体的体外培育耗时普遍较长，操作步骤繁琐，且绝大少数病原体不可培育；免疫学方法（如补体结合实验、中和实验、酶联免疫吸附实验、免疫荧光法和酶标斑点免疫法等）操作复杂，但由于病原体种类单一，已研发的抗原、抗体数量远远不能满足市场需求；PCR 检测具有极高的灵敏度和特异性，但无法完成高通量筛查，检出率较低；基因芯片技术只能对已知的病原体基因组停止意向性筛查， 而无法检测新的未知病原体。据统计，约70%的感染性疾病患者因传统检测方法无法确定病原体信息，不能失掉及时有效地救治，从而使病情好转。因此，快速、特异且高通量的病原体检测方法，对有效诊断和及时防治感染性疾病具有重要的意义。

近年来快速开展的NGS技术因其不依赖于已知核酸序列，无需特殊探针设计，可直接对未知病原微生物停止检测，打破了传统微生物检验的局限性，在临床微生物范围展现了宽广的前景。

NGS 在临床微生物检测中的运用

1. 感染性疾病的病原体鉴定

传统的病原微生物鉴定方法主要有涂片镜检、分别培育、生化反响和质谱等方法，但其存在周期长、进程复杂及灵敏度高等缺陷，如分枝杆菌菌种鉴定需求长达30～40 d的时间，而一些苛养菌及病毒对培育条件要求*苛刻，甚至不能培育。以PCR 为基础的分子诊断技术处置了上述局部病原体鉴定的效果，但难以处置未知微生物的检测难题未知微生物在未知核酸序列时无法设计引物，成为这类技术的*阻碍。NGS检测则无需对病原体停止分别培育，也不依赖已知核酸序列，可直接对标本停止测序鉴别，大大节省了检测时间，提高了诊断效率，在对未知物种及难以培育的病原体鉴定方面具有无与伦比的优势。

NGS 在病原体鉴定方面的运用主要有2种方式 ， 即rRNA基因测序和全基因组测序（whole genome sequencing, WGS）。rRNA 基因测序在临床上常用于细菌、真菌的鉴定，同时也是菌群剖析的基础。WGS与rRNA基因测序相比，可获取的信息愈加片面，适用于病毒鉴定。因大局部病毒不可培育，且高度变异，NGS 与 Sanger测序、基因芯片等法相比，效率更高，且无需设计特定探针，更适宜用于复杂临床标本中的病毒鉴定。

2. 病原体分型及盛行溯源

病原体分型方法包括基因组重复序列扩增、随 机扩增多态性 DNA、脉冲场凝胶电泳、多位点序列分型技术等。这些技术可检测病原体的型别，但分辨率较低，关于相似或变异度极高的病原体如病 毒等则常无法区别，而 NGS则补偿了此项缺陷，其可检测病原体全基因组序列，取得全部遗传信息，被以为是分辨率*的病原体分型方法。近年来，随着抗生素的不规范运用甚至滥用，使细菌耐药状况日益突出，耐药菌株在医院内的爆发盛行时有发作。因此，对盛行细菌停止追踪和溯源十分重要。在对耐药菌等病原体停止分型的基础上，判别同源性远近，分辨出不同的退化路途，可追踪或预防盛行性疾病的大爆发。

3. 病原体耐药及毒力特征检测

在抗生素和宿主免疫等多重要素的压力下，病原体在毒力和耐药方面均发作了相应改动。各种高毒力株及耐药株的出现是招致感染性疾病发病率和病死率居高不下的重要缘由。临床上病原体耐药及毒力特征的检测惯例采用体外药物敏感性实验、耐药菌表型检测或核酸扩增等方法。这些方法操作繁琐，且较费时、费力。NGS 通量高、快速，在一次测序反响中即可取得细菌整个基因组的耐药、毒力等相关基因信息，同时还可对目的基因、基因定位、基因环境、质粒相关序列等展开片面研讨，有助于提醒病原体毒力及耐药机制，对临床治疗及指点用药均具有重要意义。

4. 与人体疾病相关的微生态失衡宏基因组

宏基因组学（Metagenomics）以微生物生态群落中一切微生物的基因组为研讨对象，经过研讨群落中物种组成和功用组成、同一个群体内不同微生物的相互作用、微生物群落与宿主之间的相互作用，并停止不同表型的样品比拟、剖析，来解释生物学 现象。近年来，NGS 技术越来越普遍地被运用于肠道微生物范围的宏基因组学研讨。多项研讨标明，肠道菌群与宿主共生并共退化的进程中，在营养、代谢及免疫等多个方面影响着人体安康。肠道微生态失衡与人体多种疾病，如感染性疾病、瘦削症、糖尿病、肝病、冠心病及肿瘤等之间存在亲密关系。

肠道微生物宏基因组学研讨则为研讨肠道微生物与相关疾病的关系开拓了新途径，是近年来研讨的热点。肠道微生物中关键功用菌更是有能够成为疾病诊治的新型生物标志物和治疗靶点。此外，病毒宏基因组测序直接以环境中一切病毒的遗传物质为研讨对象，可快速鉴定一切病毒组成，在对已知或未知病毒病原体的及时发现和静态监测等方面具有突出优势，对病毒感染性疾病的防治有 重要意义。NGS因其测得数据量大、本钱低、速度快的特点，无疑将成为研讨肠道微生物和宏基因组学的有力工具。

NGS 在运用中面临的应战

目前，NGS 技术惯例运用于临床病原学检测仍存在很多实践效果:

• 病原体鉴定的准确度很大水平取决于剖析的参考数据库的范围和完整性;
• 临床标本的复杂性，能够使病原体信息太少而招致数据丧失或病原体数据混杂在正常菌群中难以区分;
• NGS测序数据的解读至关重要，测序的长度、数量、质以及试剂能够的细菌污染，均可影响病原体识别，招致标本中细菌多样性估量过高;
• 目前尚未树立不同标本测序前处置和参数设置的一致规则，微生物 NGS测序质量评价、质量控制体系亦尚在树立中。

中国基因检测行业市场快速开展，增长速度远超全球水平，未来市场空间庞大，估量2020年将增长至378.8亿元人民币。我国作为人口大国，基因检测行业已成为国度“精准医学”战略规划的重要组成局部，开展前景宽广，而病原微生物基因检测的市场有愈加宽广的空间值得我们去开拓。

参考来源：

1. 新一代测序技术在临床微生物检测中的运用

2. 感染性疾病病原学诊断新技术与临床运用战略

3. 宏基因组测序在感染性疾病病原体检测中的运用