宏基因检测（NGS）在病源微生物检测中的应用 实验员分享微生物日常检验过程注意事项 健明迪

感染性疾病是当今世界严重要挟人类安康的严重疾病。目前，全球感染性疾病的发病率有所上升，病原体出现多样化和复杂化的开展趋向。近年来快速开展的NGS技术因其不依赖于已知核酸序列，无需特殊探针设计，可直接对未知病原微生物停止检测，打破了传统微生物检验的局限性，在临床微生物范围展现了宽广的前景。

感染性疾病简介

感染性疾病多为细菌、病毒和真菌等病原体及其产物所惹起的局部或全身性炎症或器官功用阻碍，具有较大的危害性和较高的病死率。目前，全球感染性疾病的发病率有所上升，病原体出现多样化和复杂化的开展趋向。

重症急性呼吸综合征、新型冠状病毒感染、新变异型克雅病、H7N9 禽流感等新发感染性疾病不时出现。而HIV、多重或广谱耐药的结核分枝杆菌、沙眼支原体等经典感染性疾病病原体又死灰复燃或出现新的致病特征。各种新发和再发的感染性疾病、不易发现的多重感染以及不明病因的发热等，都给人类安康带来了庞大的要挟，因此，临床上对感染性疾病诊断的准确性和时效性提出了更高的要求。

感染性疾病诊断现状

快速、准确的诊断是有效治疗、病情监测和控制疾病蔓延的重要前提。随着分子检测技术的不时开展和完善，分子检测在病原微生物感染诊断及治疗监测上的临床运用日益普遍，已成为一些重要的感染性疾病的诊断和疗效评价中不可缺少的重要工具。目前常用的病原微生物分子检测方法主要包括：基于PCR的电泳法、实时荧光定量PCR（QPCR）、数字PCR、基因芯片技术、测序技术（Sanger测序技术、焦磷酸测序技术、高通量测序技术）等。

在感染性疾病范围中，取得病原体的活体（关于细菌、真菌、病毒而言，主要是培育阳性），是感染性疾病诊断的金规范，但病原体的体外培育耗时普遍较长，操作步骤繁琐，且绝大少数病原体不可培育；免疫学方法（如补体结合实验、中和实验、酶联免疫吸附实验、免疫荧光法和酶标斑点免疫法等）操作复杂，但由于病原体种类单一，已研发的抗原、抗体数量远远不能满足市场需求；PCR 检测具有极高的灵敏度和特异性，但无法完成高通量筛查，检出率较低；基因芯片技术只能对已知的病原体基因组停止意向性筛查， 而无法检测新的未知病原体。据统计，约70%的感染性疾病患者因传统检测方法无法确定病原体信息，不能失掉及时有效地救治，从而使病情好转。因此，快速、特异且高通量的病原体检测方法，对有效诊断和及时防治感染性疾病具有重要的意义。

近年来快速开展的NGS技术因其不依赖于已知核酸序列，无需特殊探针设计，可直接对未知病原微生物停止检测，打破了传统微生物检验的局限性，在临床微生物范围展现了宽广的前景。

NGS 在临床微生物检测中的运用

1. 感染性疾病的病原体鉴定

传统的病原微生物鉴定方法主要有涂片镜检、分别培育、生化反响和质谱等方法，但其存在周期长、进程复杂及灵敏度高等缺陷，如分枝杆菌菌种鉴定需求长达30～40 d的时间，而一些苛养菌及病毒对培育条件要求*苛刻，甚至不能培育。以PCR 为基础的分子诊断技术处置了上述局部病原体鉴定的效果，但难以处置未知微生物的检测难题未知微生物在未知核酸序列时无法设计引物，成为这类技术的*阻碍。NGS检测则无需对病原体停止分别培育，也不依赖已知核酸序列，可直接对标本停止测序鉴别，大大节省了检测时间，提高了诊断效率，在对未知物种及难以培育的病原体鉴定方面具有无与伦比的优势。

NGS 在病原体鉴定方面的运用主要有2种方式 ， 即rRNA基因测序和全基因组测序（whole genome sequencing, WGS）。rRNA 基因测序在临床上常用于细菌、真菌的鉴定，同时也是菌群剖析的基础。WGS与rRNA基因测序相比，可获取的信息愈加片面，适用于病毒鉴定。因大局部病毒不可培育，且高度变异，NGS 与 Sanger测序、基因芯片等法相比，效率更高，且无需设计特定探针，更适宜用于复杂临床标本中的病毒鉴定。

2. 病原体分型及盛行溯源

病原体分型方法包括基因组重复序列扩增、随 机扩增多态性 DNA、脉冲场凝胶电泳、多位点序列分型技术等。这些技术可检测病原体的型别，但分辨率较低，关于相似或变异度极高的病原体如病 毒等则常无法区别，而 NGS则补偿了此项缺陷，其可检测病原体全基因组序列，取得全部遗传信息，被以为是分辨率*的病原体分型方法。近年来，随着抗生素的不规范运用甚至滥用，使细菌耐药状况日益突出，耐药菌株在医院内的爆发盛行时有发作。因此，对盛行细菌停止追踪和溯源十分重要。在对耐药菌等病原体停止分型的基础上，判别同源性远近，分辨出不同的退化路途，可追踪或预防盛行性疾病的大爆发。

3. 病原体耐药及毒力特征检测

在抗生素和宿主免疫等多重要素的压力下，病原体在毒力和耐药方面均发作了相应改动。各种高毒力株及耐药株的出现是招致感染性疾病发病率和病死率居高不下的重要缘由。临床上病原体耐药及毒力特征的检测惯例采用体外药物敏感性实验、耐药菌表型检测或核酸扩增等方法。这些方法操作繁琐，且较费时、费力。NGS 通量高、快速，在一次测序反响中即可取得细菌整个基因组的耐药、毒力等相关基因信息，同时还可对目的基因、基因定位、基因环境、质粒相关序列等展开片面研讨，有助于提醒病原体毒力及耐药机制，对临床治疗及指点用药均具有重要意义。

4. 与人体疾病相关的微生态失衡宏基因组

宏基因组学（Metagenomics）以微生物生态群落中一切微生物的基因组为研讨对象，经过研讨群落中物种组成和功用组成、同一个群体内不同微生物的相互作用、微生物群落与宿主之间的相互作用，并停止不同表型的样品比拟、剖析，来解释生物学 现象。近年来，NGS 技术越来越普遍地被运用于肠道微生物范围的宏基因组学研讨。多项研讨标明，肠道菌群与宿主共生并共退化的进程中，在营养、代谢及免疫等多个方面影响着人体安康。肠道微生态失衡与人体多种疾病，如感染性疾病、瘦削症、糖尿病、肝病、冠心病及肿瘤等之间存在亲密关系。

肠道微生物宏基因组学研讨则为研讨肠道微生物与相关疾病的关系开拓了新途径，是近年来研讨的热点。肠道微生物中关键功用菌更是有能够成为疾病诊治的新型生物标志物和治疗靶点。此外，病毒宏基因组测序直接以环境中一切病毒的遗传物质为研讨对象，可快速鉴定一切病毒组成，在对已知或未知病毒病原体的及时发现和静态监测等方面具有突出优势，对病毒感染性疾病的防治有 重要意义。NGS因其测得数据量大、本钱低、速度快的特点，无疑将成为研讨肠道微生物和宏基因组学的有力工具。

NGS 在运用中面临的应战

目前，NGS 技术惯例运用于临床病原学检测仍存在很多实践效果:

• 病原体鉴定的准确度很大水平取决于剖析的参考数据库的范围和完整性;
• 临床标本的复杂性，能够使病原体信息太少而招致数据丧失或病原体数据混杂在正常菌群中难以区分;
• NGS测序数据的解读至关重要，测序的长度、数量、质以及试剂能够的细菌污染，均可影响病原体识别，招致标本中细菌多样性估量过高;
• 目前尚未树立不同标本测序前处置和参数设置的一致规则，微生物 NGS测序质量评价、质量控制体系亦尚在树立中。

中国基因检测行业市场快速开展，增长速度远超全球水平，未来市场空间庞大，估量2020年将增长至378.8亿元人民币。我国作为人口大国，基因检测行业已成为国度“精准医学”战略规划的重要组成局部，开展前景宽广，而病原微生物基因检测的市场有愈加宽广的空间值得我们去开拓。

参考来源：

1. 新一代测序技术在临床微生物检测中的运用

2. 感染性疾病病原学诊断新技术与临床运用战略

3. 宏基因组测序在感染性疾病病原体检测中的运用