RNA的聚丙烯酰胺凝胶电泳-上海液质检测 DNA聚丙烯酰胺凝胶电泳介绍——万融实验 健明迪检测

原理：

聚丙烯酰胺凝胶电泳是以聚丙烯酰胺凝胶为载体停止电泳的方法。核糖核酸(ribonucleicacid,RNA)分子在一定pH值的缓冲液中带有电荷,将其放人电场中，则可向与其所带电荷电性相反的电极移动。聚丙烯酰胺凝胶具有分子筛效应，核酸分子大小、外形不同，故在电场作用下,核酸分子在聚丙烯酰胺凝胶中泳动速度不同,依此可到达分别纯化的自的。本文详细引见了RNA的聚丙烯酰胺凝胶电泳，包括聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理，实验所需试剂，实验步骤。

资料、仪器设备及试剂

(一)资料

RNA样品液。

(二)仪器设备

电泳仪,玻璃管,试管架,穿刺针头,注射器。

(三)试剂

(1) 20%的单体母液:取重结晶的丙烯酰胺19.0g及甲叉双丙烯酰胺1.0g,蒸馏水溶解,稀释至100mL。

(2) Tris-硼酸一EDTA(TBE)缓冲液:称Tris 108.8 g,硼酸55.0g, EDTA -Na29.3g蒸馏水溶解,稀释至1000mL,pH为8.3。用于电极缓冲液时再稀释10倍。

(3) β一DMAPN(二甲基氨基丙腈)。

(4) 1.6%过硫酸铵溶液:称取0.16 g过硫酸铵溶于10 ml.水中。

(5) 20%蔗糖-0.2%溴酚蓝溶液:取蔗糖20g,溴酚蓝0.2 g溶子100 mL水中。

(6) 0.2%甲烯蓝染液:取0.2 g甲烯蓝溶于100 mL pH4.7的0.4 mol/L HAc缓冲液中,过滤后运用。

(7) 6%HAc液:取HAc 60 mL加水至1 000 mL。

RNA的聚丙烯酰胺凝胶电泳实验步骤：

(一)制胶

(1)取玻管(8 cmx0.5 cm)2支,下端用胶布封锁管口,垂直立在试管架上。

(2)取单体母液3 mL、缓冲液1.5 mL、β- DMAPN0.06 mL、水10 mL混匀,再加过硫酸铵0.94mL,混匀后立郎分装于各管至刻度处，沿玻管加几滴水封面，静置待凝结。

(二)加样

(1)取大批RNA样品液和RNA规范液区分如人等体积的20%蔗糖和0.2%溴酚蓝待用。

(2)剥去凝胶管下端胶布,倒出凝胶外表水,用电泳缓冲液洗濯凝胶外表三次,凝胶管内加满缓冲液,插人电泳槽中,上下槽加足电泳缓冲液,每支凝胶管加rna样品10~ 20 μL(含RNA 50~ 100 μg)。

(三)电泳

接通电泳仪电源，上槽接负极，下槽接正极。末尾时电流应小一些,以每支凝胶1~2mA为宜。待样品进人凝胶后添加至每支凝胶3mA,调至所需电流并坚持。待溴酚蓝迁移至距凝胶管下端2cm处封锁电源中止电泳,取出凝胶管。

(四)染色及观察

(1)用5mL注射器吸满蒸馏水，安上穿刺针头,针尖紧贴玻管壁,边旋边向凝胶管侧壁注入水剥离凝胶。

(2)将凝胶放入染色液中染色1 h,再用6% HAc脱色,改换数次脱色液,直到背景明晰,普通需脱色24h。

(3)将凝胶泡在6%HAc中,取出后在紫外灯下观察,比拟不异样品的电泳区带。

DNA聚丙烯酰胺凝胶电泳引见

（一）操作规程

1.清洗装配　用去污剂、水洗净玻璃板，晾干。然后依照要求装好。洗濯及装配玻璃板时必需戴手套。

2.制胶　确知玻璃板的大小和距离片的厚度，可以得知所需丙烯酰胺溶液的体积（100mL不同浓度凝胶的制备，参见表2-1）。

表2-1　制备聚丙烯酰胺凝胶所用试剂的体积

3.聚合　立刻拔出适当的梳子。室温下静置聚合5～20分钟。

4.上样　向电泳槽中参与电泳缓冲液，小心拔出梳子。用电泳缓冲液冲洗点样孔。然后上样。

5.电泳　末尾时电压为8V/cm凝胶，染料泳动至胶底约1cm时，中止电泳。

6.剖析　取下凝胶，切除凝胶的一角作为标志。染色、剖析。

（二）留意事项

1.电泳前　①整个操作进程中必需戴手套，未聚合的丙烯酰胺为神经毒性，可经过皮肤吸收，其作用具累积性。聚合的丙烯酰胺无毒，但也应戴手套，因其能够含有未聚合资料。②灌注凝胶时要防止凝胶的走漏，灌注前可用水测试一下。③一定要反省电极的衔接，正负极要对应。④要先倒电泳缓冲液，然后上样，再设定电泳条件接通电源。⑤调电流电压时，不要超出额外范围。

2.电泳时　①电泳进程中会发生少量的热，应将电泳槽放入冷藏室或冰上停止电泳。②在电泳进程中，电泳装置如有异常发热，立刻封锁电泳仪。

3.电泳后　取出凝胶时要十分小心，以免凝胶分裂影响剖析。

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