微生物检测指标 微生物检测包括哪些方面  （一）概述：NGS测序在病原微生物检测中的应用 健明迪

一、无菌操作要求

1. 接种细菌时必需穿任务服、戴任务帽。

2. 停止接种食品样品时，必需穿公用的任务服、帽及拖鞋，应放在无菌室缓冲间，任务前经紫外线消毒后运用。

3. 接种食品样品时，应在进无菌室前用肥皂洗手，然后用75％酒精棉球将手擦洁净。

4. 停止接种所用的吸管，平皿及培育基等必需经消毒灭菌，翻开包装未运用完的器皿，不能放置后再运用，金属用具应高压灭菌或用95%酒精扑灭炙烤三次后运用。

5. 从包装中取出吸管时，吸管尖部不能触及外露部位，运用吸管接种于试管或平皿时，吸管尖不得触及试管或平皿边。

6. 接种样品、转种细菌必需在酒精灯前操作，接种细菌或样品时，吸管从包装中取出后及翻开试管塞都要经过火焰消毒。

7. 接种环和针在接种细菌前应经火焰炙烤全部金属丝，必要时还要烧到环和针与杆的衔接处，接种结核菌和烈性菌的接种环应在沸水中煮沸5min，再经火焰炙烤。

8. 吸管吸取菌液或样品时，运用相应的橡皮头吸取，不得直接用口吸。

二、无菌间运用要求

1. 无菌间通向外面的窗户应为双层玻璃，并要密封，不得随意翻开并设有与无菌间大小相应的缓冲间及推拉门，另设有0.5~0.7m2的小窗，以备进入无菌间后传递物品。

2. 无菌间内应坚持清洁，任务后用2%~3%煤酚皂溶液消毒，擦拭任务台面，不得寄存与实验有关的物品。

3. 无菌间运用前后应将门关紧，翻开紫外灯，如采用室内悬吊紫外灯消毒时，需30W紫外灯，距离在1.0m处，照射时间不少于30min，运用紫外灯，应留意不得直接在紫外线下操作，以免惹起损伤，灯管每隔两周需用酒精棉球悄然擦拭，除去下面灰尘和油垢，以增加紫外线穿透的影响。

4. 处置和接种食品标本时，进入无菌间操作，不得随意出入，如需求传递物品，可经过小窗传递。

5. 在无菌间内如需求装置空调时，则应有过滤装置。

三、消毒灭菌要求

微生物检测用的玻璃器皿、金属用具及培育基、被污染和接种的培育物等，必需经灭菌前方能运用。干热和干冷高压蒸气锅灭菌方法。

1.灭菌前预备 （1）一切需求灭菌的物品首先应清洗晾干，玻璃器皿如吸管、平皿用纸包装严密，如用金属筒应将下面通气孔翻开。 （2）装培育基的三角瓶塞，用纸包好，试管盖好盖，注射器须将管芯抽出，用纱布包好。

2.装放 （1）干热灭菌器：装放物品不可过挤且不能接触箱的四壁。 （2）大型高压蒸气锅：放置灭菌物品区分包扎好，直接放入消毒筒内，物品之间不能过挤。

3.设备反省 （1）反省门的开关能否灵敏，橡皮圈有无损坏，能否平整。 （2）反省压力表蒸气排尽时能否停留在零位，关好门和盖，通蒸气或加热后，观察能否漏气，压力表与温度计所标示的状况能否吻合，管道有无梗塞。 （3）对有自动电子顺序控制装置的灭菌器，运用前应反省规则的顺序，能否契合于停止灭菌处置的要求。

4.灭菌处置

(1)干热灭菌法： 此法顺应于在干热状况下，不损坏、不蜕变、不蒸发的物品、较常用于玻璃器皿、金属制品、陶瓷制品等的灭菌。 ① 器械器皿应清洗后再干烤，以防附着在外表的污物炭化。 ② 灭菌时安放物品不能过挤，不要直接接触底和箱壁，物品之间留有空隙。 ③ 灭菌时将箱门关紧，接上电源，先将排气孔翻开约30min，扫除灭菌器中的冷空气，温度升至160℃调理指示灯，维持1.5~2h。 ④ 灭菌终了后或温度升温进程中，须在60℃以下才干翻开箱门。

(2)手提式高压锅或立式压力蒸气灭菌器的运用应按下列步骤停止： ① 手提式高压锅在主体内参与3L清水，立式高压锅加水16L（重复运用时应将水量补足，水变混浊需改换）； ② 手提式压力锅将顶盖上的排气管拔出消毒桶内壁的方管中（无软管或软管锈蚀分裂的灭菌器不得运用）； ③ 盖好顶盖拧紧，勿使漏气；置灭菌器于火源上加热，立式压力锅通上电源，并翻开顶盖上的排气阀放了冷气（水沸腾后排气10~15min）； ④ 封锁排气阀，使蒸气压上升到规则要求，并维持规则时间（按灭菌物品性质与有关状况而定）； ⑤ 到达规则时间后，对需枯燥的物品，立刻翻开排气阀排出蒸气，待压力恢复到零时，自然冷却至60℃后开盖取物，如为液体物品，不要翻开排气阀，而应立刻将锅去除热源，待自然冷却，压力恢复至零，温度降到60℃以下，再开盖取物，以防突然减压液体猛烈沸腾或容器爆破。

(3)卧式压力锅蒸气灭菌器的运用按下列步骤停止： ① 关紧锅门，翻开进气阀，将蒸气引入夹层停止预热，夹层内冷空气经阻气器自动排出； ② 夹层到达预定温度后，翻开锅室进气阀，将蒸气引入锅室，锅室内冷空气经锅室阻气器自动排出； ③ 待锅室到达规则的压力与温度时，调理进气阀，使坚持恒定； ④ 自然或人工降温至60℃再开门取物，不得运用快速排出蒸气法，以防突然降压，液体猛烈沸腾或容器爆破； ⑤ 运用自动顺序控制式压力蒸气灭菌器，在放好物品关紧门后，应依据物品类别按动相应开关，以便按要求顺序自动停止灭菌，灭菌时必需应用附设仪表记载温度与时间以备查，操作要求应严厉依照厂家说明书停止；

5.灭菌温度与时间 (1) 干热灭菌器灭菌温度160℃，1.5~2h。 (2) 压力蒸气灭菌锅灭菌温度与时间

四、间歇灭菌方法

1.灭菌方法： 应用不加压力的蒸气灭菌，某些物质经高压蒸气灭菌容易破坏，可用此法灭菌。 （1）将欲灭菌物品置于锅内，盖上顶盖，翻开排水口，使器内余水排尽。 （2）封锁排水口，翻开进气门，依据需求消毒10~20min。 （3）灭菌终了封锁进气门，取出物品待冷至室温温度，放入37℃温箱过夜，次日仍按上述方法消毒，如此三次，即可到达灭菌目的。

2.血清凝结器运用方法: 培育基中含有血清或鸡蛋特殊成份时，因高热会破坏其营养成份，故用高温，可使血清凝结，又可到达灭菌目的： （1）在运用该法灭菌的血清等分装时，需严厉遵守无菌操作，试管、平皿也经灭菌后运用； （2）将培育基按要求使成斜面或高层，加足水后，接上电源，升温75~90℃一小时后灭菌，放37℃温箱过夜，再如此灭菌三次。

3.煮沸消毒： 可用煮锅或煮沸消毒器，水沸腾后再煮5~15 min，也可在水中参与2%石炭酸煮沸5min，参与0.02%甲醛，80℃煮60min均可到达灭菌目的，但选用煮沸消毒的增消剂时，应留意对物品的腐蚀性。

4.灭菌处置: 灭菌后物品，按正常状况已属无菌，从灭菌器中取出应细心反省放置，以免再度污染； （1）物品取出，随即反省包装的完整性，若有破坏或棉塞脱掉，不可作为无菌物品运用； （2）取出的物品，如为包装有清楚的水浸者，不可作为无菌物品运用； （3）培育基或试剂等，应反省能否契合到达灭菌后的色泽或形状，未到达者应废弃； （4）启闭式容器，在取出时应将筛孔封锁； （5）取出的物品掉落在地或误放不洁处,或沾有水液,均视为遭到污染,不可作为无菌物品运用； （6）取出的合格灭菌物品，应寄存于贮藏室或防尘柜内，严禁与未灭菌物品混放； （7）凡属合格物品，应标有灭菌日期及有效期限； （8）每批灭菌处置完成后，记载灭菌品名、数量、温度、时间、操作者。

五、有毒有菌污物处置要求

微生物实验所用实验器材、培育物等未经消毒处置，一概不得带出实验室。

1. 经培育的污染资料及废弃物应放在严密的容器或铁丝筐内，并集中寄存在指定地点，待一致停止高压灭菌。

2. 经微生物污染的培育物，必需经121℃，30min高压灭菌。

3. 染菌后的吸管，运用后放入5%煤酚皂溶液或石炭酸液中，*少浸泡24h（消毒液体不得低于浸泡的高度）再经121℃，30min高压灭菌。

4. 涂片染色冲洗片的液体，普通可直接冲入下水道，烈性菌的冲洗液必需冲在烧杯中，经高压灭菌前方可倒入下水道，染色的玻片放入5%煤酚皂溶液中浸泡24h后，煮沸洗濯。做凝集实验用的玻片或平皿，必需高压灭菌后洗濯。

5. 打碎的培育物，立刻用5%煤酚皂溶液或石炭酸液喷洒和浸泡被污染部位，浸泡半小时后再擦拭洁净。

污染的任务服或停止烈性实验所穿的任务服、帽、口罩等，应放入公用消毒袋内，经高压灭菌前方能洗濯。

六、培育基制备要求

培育基制备的质量将直接影响微生物生长，由于，各种微生物对其营养要求不完全相反，培育目的的不同，各种培育基制备要求如下：

1. 依据培育基配方的成分按量称取，然后溶于蒸馏水中，在运用前对运用的试剂药品应停止质量检验。

2. pH测定及调理：pH测定要在培育基冷至室温时停止，因在热或冷的状况下，其pH有一定差异，当测定好时，按计算量参与碱或酸混匀后，应再测试一次。培育基pH值一定要准确，否则会影响微生物的生长或影响结果的观察。但需留意因高压灭菌可影响一些培育基的pH降低或降低，故不宜灭菌压力过高或次数太多，以免影响培育基的质量，指示剂、去氧胆酸钠、琼脂等普通在调完pH后再参与。

3. 培育基需坚持廓清，便于观察细菌的生长状况，培育基加热煮沸后，可用脱脂棉花或绒布过滤，以除去沉淀物，必要时可用鸡蛋白廓清处置，所用琼脂条要预先洗净晾干后运用，防止因琼脂含杂质而影响透明度。

4. 盛装培育基不宜用铁、铜等容器，运用洗净的中性硬质玻璃容器为好。

5. 培育基的灭菌既要到达完全灭菌目的，又要留意不因加热而降低其营养价值，普通121℃，15min即可，如为含有不耐高热物质的培育基如糖类、血清、明胶等，则应采用高温灭菌或间歇法灭菌，一些不能加热的试剂如亚碲酸钾、卵黄、TTC、抗菌素等，待基础琼脂高压灭菌后凉至50℃左右再参与；

6. 每批培育基制备好后，应做无菌生长实验及所检菌株生长实验。假设是生化培育基，运用规范菌株接种培育，观察生化反响结果，应呈正常反响，培育基不应贮存过久，必要时可置4℃冰箱寄存。

7. 目前，各种枯燥培育基较多，每批需用规范菌株停止生长实验或生化反响观察，各种培育基用相应菌株生长实验良好前方可运用，新购进的或寄存过久的枯燥培育基，在配制时也应测pH，运用时需依据产品说明书用量和方法停止。

8. 每批制备的培育基所用化学试剂、灭菌状况及菌株生长实验结果、制造人员等应做好记载，以备查询。

七、样品采集及处置要求

1.所采集的检验样品一定要具有代表性，采样时应首先对该批食品原料、加工、运输、贮藏方法条件、周围环境卫生状况等停止详细调查，反省能否有污染源存在。

2.依据食品的种类及数量，采样数量及方法应按规范检验方法的要求停止。

3.采样应留意无菌操作，容器必需灭菌，防止环境中微生物污染，容器不得运用煤酚皂溶液，用新洁尔灭、酒精等消毒药物灭菌，更不能含有此类消毒药物或抗生素类药物，以防止杀死样品中的微生物，所用剪、刀、匙用具也需灭菌方可运用。

4.样品采集后应立刻送往检验室停止检验，送检进程中普通不超越3h，如，路程较远，可保管在1~5℃环境中，如需冷冻者，则在冻存形状下送检。

5.检验室收到样品后，停止注销（样品称号、送检单位、数量、日期、编号等），观察样品的外观，假设发现有下列状况之一者，可拒绝检验： (1)样品经过特殊高压、煮沸或其他方法杀菌者，失掉代表原食品检验意义者； (2)瓶、袋装食品已启开者，熟肉及其制品、熟禽等食品已折碎不完整者，即失掉原食品外形者（食物中毒样品除外）； (3)按规则采样数量缺乏者； 对送检契合要求的样品，检验室收到后，应立刻停止检验，假设条件不具有，应置4℃冰箱寄存，及时预备发明条件，然后停止检验。

6.样品检验时，依据其不异性状，停止适当处置。 (1)液体样品接种时，应充沛混合平均，按量吸取停止接种。 (2)固体样品，用灭菌刀、剪取其不同部位共25g，置于225mL灭菌生理盐水或其他溶液中，用均质器搅碎混匀后，按量吸取接种。 (3)瓶、袋装食品运用灭菌操作启开，依据性状选择上述方法处置后接种。

八、 样品检验、记载和报告的要求

1. 检验室收到样品后，首先停止外观检验，及时依照国度规范检验方法停止检验，检验进程中要仔细、担任、严厉停止无菌操作，防止环境中微生物污染。

2. 样品检验进程中所用方法、出现的现象和结果等均要用文字写出实验记载，以作为对结果剖析、判定的依据，记载要求详细、清楚、真实、客观、不得涂改和伪造。

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❝ NGS技术在临床上的运用逐渐趋于成熟，从早期的肿瘤基因检测，到如今大热的微生物病原核酸检测，NGS技术以其快速、准确和高分辨率的特点，发扬着无可替代的作用。 ❞

微生物在地球上无处不在，从陆地到陆地，从衣物到皮肤，甚至我们的身体外部。

繁衍、变异、自然选择和生活妥协，是一切生物必需阅历的。

由于生命的*要义，是生活。

为了生活，必需妥协，生物之间为了争夺资源，以及生物与自然环境之间，都存在着妥协 ，在这个进程中，有些微生物可以与人类战争共处，甚至互利共生，而有的微生物则会使人患病，通常有细菌、真菌、病毒、支原体，以及衣原体，这些就是临床上的病原微生物。

自然选择需求阅历漫长的进程，但是近年来环境污染，药物滥用，加快了病原微生物的退化速度，耐药菌，超级菌的出现，严重要挟着人类安康。

还有一些微生物，原本与人类没有交集，原先只存在于自然界，而有人为了猎奇，食用野生植物，从而把这些植物身上携带的病毒带到了人类社会，如本世纪初的非典病毒（Severe Acute Respiratory Syndromes, SARS）就是例子，这类新型病毒对公共卫生安康构成了庞大的应战，一般人的贪心，给全世界的人们带来了庞大的灾难。

当安康遭到了要挟，对付细菌，人类发明了抗生素， 对付病毒，发明了抗病毒药物，但要如何治疗，*步是找出元凶，而这在临床上往往存在困难。

传统的血惯例，或许器官和组织的影像学目的可以判别感染的能够性，但并不能作为确诊的依据，比如血惯例只能通知你能否有细菌或病毒感染，但不能通知你是什么细菌或病毒，还需求进一步反省才干确诊，以便有的放矢。

实验室反省，如抗原检测、核酸检测、代谢产物检测以及毒素检测才是明白感染、指点治疗和判别预后的重要手腕。

• 细菌和真菌检测。通常需求先停止分别培育，再结合生化反响停止鉴定，并进一步停止药物敏理性实验，这种形式是临床微生物实验室习用的经典形式，为临床处置了很多关键效果，但是其周期长、阳性率低、通量高等弊端往往难以满足临床日益增长的需求。
• 病毒、支原体、衣原体检测。难以像细菌一样停止分别培育，通常采用分子生物学方法如聚合酶链式反响（Polymerase Chain Reaction, PCR）测定核酸，灵敏快速，但只限于已知病原体的检测，且检测结果提供的信息相对有限，难以处置由变异带来的医学效果。

为了克制传统方法的缺乏，下一代测序技术（Next-generation sequencing technology，NGS）在病原微生物检测中的应用具有十分大的优势，如：

• 通量大，一次可检测成百上千个物种，特别是未知的病原，测定其核酸序列是必不可少的手腕；
• 直接测定病原微生物的核酸序列，能为临床提供准确的诊断依据，如物种鉴定、分型以及耐药突变等；
• 更低的检测限，即使病原微生物的丰度很低，也可以检测到。

当然，NGS的缺陷也是有的：

• 相关于PCR，时效性处于优势；
• 本钱较高，暂时不会完全取代现行的惯例鉴定手腕。

即使有缺乏，但NGS的技术优势更为清楚，在疑问微生物，以及难以培育甚至无法分别培育的少见菌属的鉴定，特别是新型病原微生物的爆发盛行监测方面，NGS快速、准确和高分辨率的特点，使其成为病毒鉴定的金规范，在盛行病学分型中发扬着重要作用。

新型冠状病毒（Corona Virus Disease 2019, COVID-19）正暴虐全球，目前尚无疫苗和*药，人们除了戴口罩，留意团体卫生以及添加社交距离外别无他法，面对汹涌的疫情，再一次提示人类，要放下自己是万物之灵的高傲，由于微生物才是当之无愧的地球*，它们在这个星球上生活的历史比人类更长，种类和数量也比人类要多得多。

我们不能，也不应该试图消灭一切微生物。我们之间的关系，不只要对立，还有协作，但是当我们的安康遭到要挟时，也要勇于妥协。

物竞天择，适者生活，人类与微生物的协作与妥协，必将永远停止下去。