H1N1滴鼻感染雪貂模型

到目前为止，已经报道有2种非人灵长类动物（恒河猴、食蟹猴）和4种啮齿类动物（大鼠、小鼠、田鼠、沙鼠），雪貂、家猫以及鸡、鸭等禽类可以作为H5N1禽流感病毒动物模型用于实验研究。低致病性H5N1禽流感病毒可以通过适应建立鼠肺适应株感染小鼠建立小鼠模型。非人灵长类动物通过鼻腔吸入较难感染，通常需要借助辅助器材进行定位感染，动物感染后体征变化不显著，肺组织出现局灶性病变。

前期研究显示雪貂的受体分布情况与人极为接近，呼吸气道长，上下呼吸道分腔明显是流感病毒研究最为理想的动物模型，缺点是雪貂受物种特异性限制缺乏相应的检测试剂。小鼠对多种流感病毒敏感，一直被选择作为流感病毒研究的动物模型，不仅有完备的检测试剂，还有相应的基因敲除、转基因小鼠可用于机制方面的研究。早期研究曾在多种非人灵长类动物中（非洲绿猴、Pata猴、猪尾猴、食蟹猴）检测到血清抗体阳性，并推测猴群感染病毒参与了流感大流行。研究发现非人灵长类动物感染禽流感病毒后的临床改变、病理变化、抗原分布都与人类存在一定差异，研究结果显示其对流感病毒敏感性较雪貂、小鼠低。至今没有直接证据表明非人灵长类动物的受体分布情况与人接近。恒河猴中研究局部肺组织损伤机制不仅与巨噬细胞有关，在研究抗补体机制中还应考虑PAMP的参与，NF-κB 等炎症信号途径的作用，这些研究在非人灵长类中受到一定限制，目前小鼠可以提供多方面抗补体机制研究。

受体比较

1) 人呼吸道上皮受体分布情况：α-2，6连接唾液酸糖蛋白受体主要分布在鼻粘膜上皮细胞, α-2，3连接唾液酸糖蛋白受体分布在鼻旁窦、咽、气管、细支气管上皮上。在终端呼吸性细支气管上皮细胞也表达α-2，6连接唾液酸糖蛋白受体。α-2，3连接唾液酸糖蛋白受体出现在呼吸细支气管与肺泡交界的无纤毛立方细支气管细胞上，部分肺泡壁细胞表达这种受体，这种细胞为肺泡Ⅱ型细胞。病人感染H5N1禽流感病毒后，病毒主要分布在肺泡Ⅱ型细胞内。

2) 雪貂除了气管中极少数杯状细胞既表达α-2，3SA受体又α-2，6SA受体，其上下呼吸道受体分布与人极为相似，小鼠多表达α-2，3SA受体，α-2，6SA受体较少，曾局限的认为小鼠较适合用于α-2，3SA受体结合的病毒研究，后有研究发现受体特异性并不影响某些病毒对小鼠的致病力和复制能力。

3)有研究显示通过体外实验证实非洲绿猴上皮细胞与人类流感病毒和禽类流感病毒都有较好的结合能力，与人类上皮细胞的结合能力接近。缺乏实验证据显示其受体与人类受体分布相似度。

6.2感染途径比较

1) 小鼠、雪貂通过轻微麻醉后，以吸入式方式感染，感染方式与人极为接近。

2) 恒河猴、绿猴、食蟹猴等需要以环甲膜穿刺、支气管镜定位感染等方式进行感染，感染途径与自然感染途径差别较大，感染效果通常会出现肺组织局域性灶状感染，与吸入性感染方式产生的病变程度、范围存在一定差别。

感染后症状

1) 部分禽流感病毒在猴上皮细胞中复制受限或者发生不同程度的衰减。例如禽来源的H2N2病毒不能感染猴，H5N1高致病性禽流感病毒需要以高出雪貂感染剂量103倍的剂量感染猴，仍不致死，仅产生一过性体温升高。

2) 几乎所有禽流感病毒都能够在雪貂中成功复制，并产生临床可观察的改变，例如体温升高、体重下降、喷嚏、流涕、精神萎靡甚至死亡。

3)H5N1禽流感病毒感染小鼠后出现严重的肺炎，除呼吸道以外还在脑、脾、肝等组织中发现病毒抗原，并在脑组织中出病理改变，猴感染后在呼吸道以外的组织中未发现病毒抗原。

CRP基因敲除小鼠和人CRP转基因小鼠在赛业（苏州）生物科技有限公司模式动物研究中心完成，该中心具有符合国际标准的动物模型制备相关完备监督管理制度。动物的繁殖及感染模型评估在中国疾控中心动物中心完成，所有操作在SFP级别下遵守二级生物安全管理规定进行，实验动物尸体实行无害化处理，对生态环境无影响。

1. 雪貂模型感染后临床表现

雪貂感染致死剂量的甲型H1N1病毒后表现出显著的临床症状变化，第2天摄食量减少，第3天活动减少，精神萎靡，眼半闭，呼吸微弱，对外界刺激无反应，呈濒死状态（图1）。根据其表现设立了评分标准：NIH提供的雪貂感染实验观察指标分为鼻部症状和活动度两个部分，具体指标见表1。雪貂感染甲型H1N1后的临床症状评分如图2所示。

图1雪貂感染甲型H1N1病毒后的临床表现

表1雪貂感染后临床评分标准

图2雪貂感染甲型H1N1病毒后的临床症状评分

雪貂感染后第1天体温显著上升至40℃以上，随后逐渐下降到正常水平（图3）。感染后第4天开始体重显著下降，最高降幅达23% （图4）。

图3雪貂感染甲型H1N1病毒后的体温变化情况

图4雪貂感染甲型H1N1病毒后的体重变化情况

2. 雪貂模型感染后病毒在组织中复制情况

攻毒后第7天安乐雪貂，取主要组织脏器进行病毒载量测定，结果显示气管、心、脾、肾及脑组织中均可检测到高载量的病毒。

3. 雪貂模型感染后病毒在上呼吸道中动态复制情况

雪貂感染甲型H1N1病毒后，每天刮取其上呼吸道拭子，检测病毒动态复制情况，结果显示鼻拭子中甲型H1N1病毒的携带情况显著高于咽拭子，咽拭子于感染后第4天达到峰值，鼻拭子在感染后2-5天均保持较恒定的高水平复制状态（图5）。

图5雪貂感染甲型H1N1病毒后在上呼吸道中动态复制情况

4. 雪貂模型感染后肺组织病理检测结果

病理结果显示，雪貂感染甲型H1N1病毒后肺部可见点灶状暗红色区域或片状病变，切面亦可见点灶状暗红色区域（图6）。

图6雪貂感染甲型H1N1病毒后肺组织病理检测情况. A：正常肺组织对照（×40）；B：弥漫性间质性肺炎（×40）；C：弥漫性间质性肺炎（×100）；D：免疫组化显示感染甲型H1N1病毒的上皮细胞呈阳性（×100）。

5. 雪貂模型感染后特异性抗血清产生及持续情况

血凝抑制实验结果显示，雪貂感染甲型H1N1病毒后，于感染后第9天达到峰值，HI效价可达1：1280，感染后第19天抗体效价降至1：640，并可持续至感染后第89天（图7）。

图7雪貂模型感染后特异性抗血清产生及持续情况

雪貂呼吸道解剖结构上下呼吸道分腔明显，受体分布与人极为接近，是迄今为止最为敏感的流感病毒感染动物模型。它对人流感病毒高度易感，病毒不经适应即能使雪貂致病，并易传播给雪貂和人。在自然条件下，雪貂一般也是通过呼吸道吸入病毒的方式感染流感病毒，其感染后的发病过程和机体反应也与人体相似。雪貂除对人流感病毒高度易感外，对禽流感、猪流感病毒也十分敏感，且感染后出现典型症状。

分子生物学研究显示，这是由于雪貂的呼吸道上皮细胞表面存在人流感病毒特异性受体α2,6糖键连接的唾液酸，而其肺泡上皮细胞表面也存在着禽流感病毒特异性受体α2,3糖键连接的唾液酸。

概括起来，相较于其他流感动物模型，雪貂的优势为 ：（1）雪貂感染流感病毒后的症状、发病机制和免疫反应与人类极为相似。（2）人甲、乙型流感病毒均可自然感染雪貂，这为在完全控制的群体内观察流感的传播规律和流感病毒抗原性的漂移和转变提供了可能。（3）雪貂的气管较长，这样就使其上、下呼吸道区室化，有利于研究流感病毒对呼吸道不同区域的效应差异。（4）雪貂作为动物模型比啮齿类大，易于监测其体温、脉搏和呼吸频率。（5）在小型动物中，雪貂是唯一感染甲型流感病毒后自然出现发热反应的动物模型。基于此，目前雪貂作为理想的流感动物模型已被广泛应用于流感发病机理等各方面的研究，为人类流感研究做出了重要贡献。

去势雪貂（Mustela Pulourius Furo），4-10月龄，500-1000克。实验前进行血清学检查，HI方法检测血清甲型H1N1抗体，抗体阴性为合格雪貂方可入组实验。

雪貂经过轻度麻醉后滴鼻感染甲型H1N1病毒。实验的观察期为10天。皮下植入体温芯片用于监测体温、体重变化。每日观察雪貂临床症变化，在感染后第5天处死动物，取组织样本用于监测病毒复制动力曲线和动物感染后组织炎症反应检查。

流感是由流感病毒引起的一种急性呼吸道传染病，它通过飞沫传播，能在短时间内迅速蔓延。2009年起源于北美的甲型H1N1流感曾经造成世界范围内的大流行，WHO曾将其警戒级别提升至最高级别6级，给人类社会和经济造成极大的负面影响。一项由WHO组织开展的研究显示，在2009至2010年的流感季中，全世界共有20%至27%的人被甲型H1N1病毒感染。尽管2010年8月WHO宣布已进入“流感大流行后期”，意味着“正常监测显示大多数国家的流感活动水平已恢复到季节性流感水平”，但同时指出，“局部地区仍有暴发甲型H1N1流感疫情的可能。”

本次疫情患者感染的是一种H1N1亚型流感病毒新毒株，它包含人流感病毒、北美禽流感病毒和北美、欧洲、亚洲三类H1N1流感病毒的基因片段。这种病毒已被证实经由人际传播，人感染后会出现高烧、精神不振、厌食、咳嗽等症状。科学家指出，打喷嚏、咳嗽和物理接触都有可能导致甲型H1N1流感病毒在人群间传播。这次甲型H1N1流感病毒呈现的另一大特点是对青壮年攻击性强，目前确诊甲型H1N1流感死者中大多数年龄都在25~ 45岁之间。

疾病临床表现及致病机制

根据甲型H1N1流感病毒特性，该病的传播途径可能是通过近距离空气飞沫传播，以及接触病猪、病人呼吸道分泌物和密切接触造成传播。传播模式为：（1）主要是由于人吸入感染猪、人的分泌物或排泄物；（2）直接接触病猪、人后，通过人的消化道，呼吸道，皮肤损伤和眼结膜等途径传播；（3）现有资料尚不支持垂直传播的存在；4）而在猪、人中是多途径传播的。可通过空气飞沫,水源,密切接触,垂直传播,人的机械传播和蚊虫叮咬传播等。

大多数人感染甲型H1N1病毒后仅表现为轻症，而少数患者感染后，会表现出迅速加重的下呼吸道感染，发生急性肺损伤（ALI）、急性呼吸窘迫综合症（ARDS），甚至呼吸衰竭、多器官功能障碍综合症（MODS）等，危及患者生命。