EV71感染SCARB2转基因小鼠模型

采用病毒滴度为104.5 TCID50/ml的EV71（NX10-147）经腹腔注射感染9日龄BALB/c乳鼠，建立重症小鼠模型，6 dpi重症模型小鼠发生后肢瘫痪最终导致死亡；绘制生存率（图1A），体重增长曲线（图1B），临床评分（图1C）。重症小鼠模型在5 dpi时，2/7(28.57%)小鼠发生后肢瘫痪（图2），在7 dpi时，4/7(57.14%)小鼠表现瘫痪，其体重也下降，11~12 dpi重症小鼠出现死亡，生存率为71.43%(5/7)，其中存活的小鼠中60%(3/5)出现瘫痪后遗症。

1.重症小鼠模型各组织病毒载量检测

为了进一步探讨重症EV71小鼠模型体内病毒载量情况，采用RT-PCR对3 dpi和5 dpi重症小鼠脑、脊髓、骨骼肌、空肠和肺组织进行病毒核酸检测（图3），发现以上各组织在3 dpi和5 dpi 均检测到EV71病毒，其中，检测到重症模型3 dpi骨骼肌中的高病毒载量（107.0 copies/mg），其中，3 dpi 在重症模型脑组织中均检测到低病毒载量(102.0 copies/mg)，5 dpi脑组织中病毒载量增加到104.0 copies/mg，说明5 dpi EV71病毒造成中枢神经系统感染加重。3 dpi在重症模型脊髓、空肠和肺组织中的病毒载量104.0 copies/mg，5 dpi 病毒载量无明显变化，重症小鼠模型中均检测到骨骼肌和脊髓中较高的病毒载量，说明这些组织是病毒复制并传播到脑组织的重要部位。

2.重症小鼠模型组织病理学变化

运用组织病理学和免疫组织化学技术，对重症小鼠模型的各组织器官进行病理学观察。空白对照组小鼠未见明显病理变化，并且EV71抗原呈阴性反应。

对重症小鼠模型（NX10-147）进行组织病理学观察（图4），发现3 dpi和5 dpi 小鼠后肢骨骼肌发生严重的坏死性肌炎，肌纤维断裂，大量炎性细胞浸润，主要有淋巴细胞、嗜中性粒细胞、巨噬细胞；3 dpi 小鼠脊髓和脑干发生细胞源性水肿，神经元发生变性，偶见坏死，5 dpi小鼠脊髓前角运动神经元变性坏死，出现红色神经元，并可见卫星现象和嗜神经现象，脑干组织中的神经元发生不同程度的变性坏死，并且可见脑干和脊髓神经元中的尼氏小体消失；5 dpi肺脏发生大面积间质性肺炎，间质增宽，炎性细胞浸润，肺泡间隔毛细血管淤血，3 dpi和5 dpi肺脏发生局灶性肺气肿；3 dpi和5 dpi空肠黏膜上皮细胞发生大面积空泡变性。免疫组织化学检测发现在上述严重病变的组织中可观察到EV71特异性抗原分布（图5），在3dpi和5 dpi时，脊髓、脑干、空肠和骨骼肌检测到较强的阳性EV71抗原信号，提示在这些组织中病毒复制活跃，然而在5 dpi时，肺脏检测到中等强度阳性EV71抗原信号。

3.重症小鼠模型血清细胞因子检测

对重症小鼠模型进行血清细胞因子检测从血清细胞因子方面揭示重症发生机制。本研究采用CBA方法检测了重症小鼠的3、6、12 hpi 以及1、2、3、5、7、9 dpi的血清细胞因子IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-13、TNF-α、IFN-γ，以及MCP-1、CCL5/RANTES的动态变化。结果发现，这些血清因子中，IL-5、IL-13、IL-6、MCP-1、CCL5、TNF-α在重症小鼠中发生某时间点的爆发性浓度增高，与空白对照组小鼠血清因子相比，发现重症小鼠血清爆发性增高的细胞因子分别是3 hpi重症IL-5上调4倍；48 hpi重症IL-13上调1.2倍；3 dpi重症IL-6、MCP-1都上调100倍以上；3 dpi和7 dpi重症CCL5/RANTES分别上调9倍和10倍；重症小鼠模型中的IFN-γ在5 dpi时达到峰值，重症为10倍；7 dpi重症TNF-α和MCP-1分别上调4倍和87倍。以上数据说明，IL-5和IL-13可能是EV71小鼠实验感染早期炎症反应的主要因素，并且细胞因子IL-6、TNF-α、IFN-γ、MCP-1、CCL5/RANTES在重症EV71实验感染的免疫病理损伤中发挥重要作用。

4. EV71重症小鼠模型的气道阻力和血气分析

对小鼠的气道阻力进行分析，发现小鼠的吸气时间延长，呼吸频率降低，分钟通气量显著降低，符合限制性通气不足的特征，可能是小鼠死亡的主要原因之一。

采用血气分析方法对EV71重症小鼠模型组和对照组小鼠的呼吸效果进行分析，与对照组相比，4 dpi感染组小鼠的氧分压（PO2）和氧饱和度（sO2）均明显下降，PO2 由62.2 mmHg下降到 46.75 mmHg，差异极显著（p < 0.01）；sO2由90.6 %下降到76.5 %，差异极显著（p< 0.01），PO2和sO2的变化提示EV71重症模型组小鼠处于缺氧状态。并且发现二氧化碳分压（PCO2）和二氧化碳总量（TCO2）有所上升，PCO2由27.22 mmHg增加到46.25 mmHg，差异显著（p< 0.05）；TCO2由24.00 mmol/L 增加到25.75 mmol/L，PCO2的变化提示EV71重症模型组小鼠肺通气效果可能存在障碍。进一步发现了血液酸碱度pH值和细胞外液碱剩余（BEecf）均明显下降，pH值由7.42下降到7.33，差异显著（p< 0.05）；BEecf由1 mmol/L降低到–2.25 mmol/L，差异显著（p < 0.05），提示重症模型组小鼠可能处于呼吸性酸中毒的状态。以上血气结果结合肺脏组织病理变化，说明EV71重症模型组小鼠肺脏通气功能低下，处于缺氧和呼吸性酸中毒的病理状态。

5. EV71小鼠模型超微病理学变化

对照组小鼠肌肉组织可见横纹明显，每条肌原纤维都可见清晰明带和暗带交替排列，肌质内含有丰富的线粒体、肌原纤维、高尔基复合体、溶酶体、糖原颗粒等肌浆内含物，糖原颗粒散在分布于肌原纤维间和肌浆中，肌细胞内可见清晰的线粒体，或在肌纤维间排列，其内外膜和嵴突结构清晰可见。感染组小鼠肌肉组织超微病变明显，表现为肌组织横纹消失，明暗带模糊甚至消失，肌组织发生退行性变，细胞内出现水肿，部分肌原纤维发生溶解，肌质中的胞浆内容物减少，糖原颗粒甚至消失；线粒体肿胀、空化，基质电子密度降低，内室肿胀，嵴和膜结构模糊，嵴突变短减少，崩解消失，形成灶性空化；骨骼肌细胞核固缩，染色质边集，异染色质明显增多，发生变性、坏死。并且在肌纤维间可见巨噬细胞、中性粒细胞等炎性细胞浸润。

对照组脑组织中神经元胞浆中的细胞器丰富，内质网发达，平行或不规则排列，其间游离存在核糖体；线粒体丰富，散布于整个胞体中，线粒体内外膜和嵴突结构清晰；脑组织中有髓神经纤维髓鞘电子密度均匀。感染组脑组织超微病变轻微，神经元细胞器丰富，内质网发达，线粒体丰富；神经元胞浆中可见少量空泡，部分线粒体内室肿胀；有髓神经纤维髓鞘发生层面分离，导致小泡性分离，呈现泡状改变。

对照组脊髓前角神经元常染色质明显，异染色质少，细胞器丰富；脊髓前角神经元胞质中线粒体丰富，内质网发达。感染组脊髓前角神经元中粗面内质网扩张，出现尼氏小体溶解，核周见微空泡形成；胞核皱缩，异染色质增多，细胞器减少，粗面内质网和高尔基复合体呈现不同程度的扩张，细胞质呈筛状外观，并伴随不同程度的多聚核糖体丢失，导致粗面内质网脱颗粒；线粒体肿胀，线粒体嵴突肿胀，嵴数量减少。小胶质细胞包围吞噬神经元细胞，呈现嗜神经现象。

对照组肺组织中I型上皮细胞扁平，其细胞核内可见呈浅亮的常染色质和呈深色颗粒状的异染色质，胞质少而薄，胞浆内可见少量细胞器，与周围细胞连接紧密；肺组织中的II型上皮细胞核大而圆，常染色质细密，异染色质少，粗面内质网、高尔基复合体、溶酶体等细胞器丰富；II型上皮细胞胞浆中可见清晰的特征性包含物——嗜锇性板层小体。感染组肺组织中I型上皮细胞核中染色质边集，呈不规则堆积，并且与周围细胞之间连接松弛；肺组织中II型上皮细胞核形状不规则，染色质边集，核周细胞质电子密度降低，粗面内质网、核糖体、高尔基复合体等细胞器减少，胞质出现细小空泡变，嗜锇性板层小体或出现排空现象，溶酶体增多；肺泡壁中的细胞成分增多，其中肺泡II型上皮细胞增生，发生了间质性肺炎。

H1PV为低于人间传染病名录三级安全风险的病原，人类感染风险低。

H1PV是大鼠必须排除的病原体，对动物有致病性。会干扰其他实验研究。

鉴于此，此感染实验必须在BSL-2级以上的生物安全实验室进行病原学实验，在ABSL-2实验室进行动物实验。

pCMV6-XL5-h-SCARB2质粒购自美国Origene公司（Clone ID NM_002257）。EcoR I和Xho I酶切回收h-SCARB2片段，并克隆入pCDNA3.1(+)质粒中巨细胞瘤病毒（CMV）启动子下游，构建全身表达人SCARB2的载体。转基因载体经测序验证后，用Pvu I将载体线性化，Sephedex G50柱纯化。将DNA浓度调整至5 ng/uL，用显微注射法将DNA注射到C57BL/6J小鼠的受精卵中，用ICR小鼠作假孕受体，制备转基因小鼠。经鼠尾DNA PCR对首建鼠的基因型进行鉴定，得到阳性首建鼠3只（图1A）。随后，用逆转录PCR分析了首建鼠F1代组织中目的基因的表达情况，发现人SCARB2主要在转基因小鼠的骨骼肌和脑组织中表达（图1B）。随后，分别用Western Blot和免疫组化分析了人SCARB2蛋白在脑和骨骼肌组织中的表达情况。由于人SCARB2与小鼠SCARB2同源性较高，存在抗体交叉结合现象。Western Blot发现转基因小鼠脑和骨骼肌组织中SCARB2蛋白表达量高于同窝阴性（图1C-1D）。免疫组化发现SCARB2蛋白主要分布于转基因小鼠的骨骼肌和脑组织中（图2A-2B），该结果表明成功建立了脑和肌肉组织表达人SCARB2蛋白的转基因小鼠。

注：M：DNA分子质量标准；1-15：首建鼠；NTG：同窝阴性小鼠；TG：转基因小鼠；A：PCR鉴定阳性首建鼠；B：逆转录PCR分析转基因小鼠组织内人SCARB2基因表达；C： Western Blot分析人SCARB2蛋白在转基因小鼠脑组织中的表达，GAPDH为内参；D： Western Blot分析人SCARB2蛋白在转基因小鼠骨骼肌组织中的表达，GAPDH为内参。

Note: M: DNAmolecular weight standard; Lane1-15:Transgenic mouse line; NTG: Negative littermates; TG: Transgenicmice; A:Transgenic mice lines identification by PCR using the tail genomic DNAas template; B: Reverse-transcriptase PCR analysis the human SCARB2 geneexpression in tissues of Tg mice; C: Western blot detected the expression of human SCARB2protein synthesis in brain of Tg mice; D: Western blot detected the expression of human SCARB2protein synthesis in muscle of Tg mice. The data were normalized to GAPDHexpression

EV71感染SCARB2转基因幼鼠表型

为研究表达人SCARB2对EV71感染转基因小鼠的促进作用。我们分别用MP10毒株感染不同年龄段的小鼠，发现两周龄以下的转基因小鼠和野生型小鼠在感染病毒后，会于10天内死亡，肌肉组织内病毒载量超过108拷贝/毫克，转基因小鼠与野生型小鼠在病毒复制方面差别不大。因此，我们用２ ×１０６ ＴＣＩＤ５０MP10毒株200uL分别感染了21日龄的转基因小鼠和野生型小鼠，主要研究了表达人SCARB2受体组织内的病毒复制情况。发现在感染后3天（病毒复制的最高峰）转基因小鼠骨骼肌和脑中EV71的拷贝数显著高于同窝阴性小鼠（图3A-3B），随后，用免疫组化研究了组织内的病毒分布情况。EV71抗原主要分布于转基因小鼠的脑组织中，而野生型小鼠脑组织中未检测到病毒抗原（图4A）。转基因小鼠骨骼肌组织内均分布着大量的EV71抗原，与和野生型小鼠比两者间差异明显（图4B）。表明表达人SCARB2可促进EV71对转基因小鼠组织的感染，证实该蛋白在体内可发挥EV71受体的功能。

SCARB2转基因动物模型，无特定病原体(specific-pathogen free，SPF) ICR小鼠，6周龄，雌性，体重18-20g。

背景品系为ICR封闭群小鼠， Hauschka用Swiss小鼠群以多产为目标，进行选育，以后美国癌症研究所（Institute of Cancer Research）分送各国饲养实验，各国称为ICR。

人肠道病毒71型（EV71）是微核糖核酸病毒科肠病毒属肠病毒种A型RNA病毒， 1969年首次在加利福尼亚神经异常的病人体内分离并鉴定。EV71被认为是婴幼儿手足口病(HFMD)的主要病原体之一。该病毒感染偶尔伴随严重的并发症，包括脑干脑炎、无菌性脑膜炎、肺水肿或肺出血、急性弛缓性麻痹和心力衰竭。最近几十年，EV71感染引起的手足口病疫情在世界范围内大爆发，目前主要集中于亚太地区。中国大陆的EV71病毒感染始见于1987年冬季湖北省HFMD的流行，自1999年以来，我国广东、福建、上海、重庆等地区也报告了局部流行的EV71感染，与1998年台湾地区报道120,000例爆发手足口病，其中有78例死亡不同，大陆EV71引起的HFMD和神经系统症状较轻。以往研究认为人脊髓和脑干是EV71感染的靶标，但其感染机制和致病机制尚不明确。

2009年日本学者首次利用细胞实验鉴定了EV71的两种人受体蛋白，分别为P选择素糖蛋白配体1(P-selectin glycoprotein ligand-1，PSGL-1)和人清道夫受体B2（SCARB2）。通过建立表达PSGl-1的转基因小鼠，我们证实人PSGL-1有一定的促进EV71感染转基因小鼠的功能。为进一步在体内证实人SCARB2的受体功能，以期改良现有的EV71感染小鼠模型，我们通过建立表达人SCARB2基因的转基因小鼠，在体内验证了该蛋白的受体功能。