H3N2滴鼻感染BALB/c小鼠模型

到目前为止，已经报道有2种非人灵长类动物（恒河猴、食蟹猴）和4种啮齿类动物（大鼠、小鼠、田鼠、沙鼠），雪貂、家猫以及鸡、鸭等禽类可以作为H5N1禽流感病毒动物模型用于实验研究。低致病性H5N1禽流感病毒可以通过适应建立鼠肺适应株感染小鼠建立小鼠模型。非人灵长类动物通过鼻腔吸入较难感染，通常需要借助辅助器材进行定位感染，动物感染后体征变化不显著，肺组织出现局灶性病变。

前期研究显示雪貂的受体分布情况与人极为接近，呼吸气道长，上下呼吸道分腔明显是流感病毒研究最为理想的动物模型，缺点是雪貂受物种特异性限制缺乏相应的检测试剂。小鼠对多种流感病毒敏感，一直被选择作为流感病毒研究的动物模型，不仅有完备的检测试剂，还有相应的基因敲除、转基因小鼠可用于机制方面的研究。早期研究曾在多种非人灵长类动物中（非洲绿猴、Pata猴、猪尾猴、食蟹猴）检测到血清抗体阳性，并推测猴群感染病毒参与了流感大流行。研究发现非人灵长类动物感染禽流感病毒后的临床改变、病理变化、抗原分布都与人类存在一定差异，研究结果显示其对流感病毒敏感性较雪貂、小鼠低。至今没有直接证据表明非人灵长类动物的受体分布情况与人接近。恒河猴中研究局部肺组织损伤机制不仅与巨噬细胞有关，在研究抗补体机制中还应考虑PAMP的参与，NF-κB 等炎症信号途径的作用，这些研究在非人灵长类中受到一定限制，目前小鼠可以提供多方面抗补体机制研究。

受体比较

1) 人呼吸道上皮受体分布情况：α-2，6连接唾液酸糖蛋白受体主要分布在鼻粘膜上皮细胞, α-2，3连接唾液酸糖蛋白受体分布在鼻旁窦、咽、气管、细支气管上皮上。在终端呼吸性细支气管上皮细胞也表达α-2，6连接唾液酸糖蛋白受体。α-2，3连接唾液酸糖蛋白受体出现在呼吸细支气管与肺泡交界的无纤毛立方细支气管细胞上，部分肺泡壁细胞表达这种受体，这种细胞为肺泡Ⅱ型细胞。病人感染H5N1禽流感病毒后，病毒主要分布在肺泡Ⅱ型细胞内。

2) 雪貂除了气管中极少数杯状细胞既表达α-2，3SA受体又α-2，6SA受体，其上下呼吸道受体分布与人极为相似，小鼠多表达α-2，3SA受体，α-2，6SA受体较少，曾局限的认为小鼠较适合用于α-2，3SA受体结合的病毒研究，后有研究发现受体特异性并不影响某些病毒对小鼠的致病力和复制能力。

3)有研究显示通过体外实验证实非洲绿猴上皮细胞与人类流感病毒和禽类流感病毒都有较好的结合能力，与人类上皮细胞的结合能力接近。缺乏实验证据显示其受体与人类受体分布相似度。

6.2感染途径比较

1) 小鼠、雪貂通过轻微麻醉后，以吸入式方式感染，感染方式与人极为接近。

2) 恒河猴、绿猴、食蟹猴等需要以环甲膜穿刺、支气管镜定位感染等方式进行感染，感染途径与自然感染途径差别较大，感染效果通常会出现肺组织局域性灶状感染，与吸入性感染方式产生的病变程度、范围存在一定差别。

感染后症状

1) 部分禽流感病毒在猴上皮细胞中复制受限或者发生不同程度的衰减。例如禽来源的H2N2病毒不能感染猴，H5N1高致病性禽流感病毒需要以高出雪貂感染剂量103倍的剂量感染猴，仍不致死，仅产生一过性体温升高。

2) 几乎所有禽流感病毒都能够在雪貂中成功复制，并产生临床可观察的改变，例如体温升高、体重下降、喷嚏、流涕、精神萎靡甚至死亡。

3)H5N1禽流感病毒感染小鼠后出现严重的肺炎，除呼吸道以外还在脑、脾、肝等组织中发现病毒抗原，并在脑组织中出病理改变，猴感染后在呼吸道以外的组织中未发现病毒抗原。

CRP基因敲除小鼠和人CRP转基因小鼠在赛业（苏州）生物科技有限公司模式动物研究中心完成，该中心具有符合国际标准的动物模型制备相关完备监督管理制度。动物的繁殖及感染模型评估在中国疾控中心动物中心完成，所有操作在SFP级别下遵守二级生物安全管理规定进行，实验动物尸体实行无害化处理，对生态环境无影响。

1. 小鼠模型感染病毒后临床症状变化

小鼠感染病毒后，感染后的临床表现为：感染后的第3天，小鼠开始出现了弓背、竖毛、蜷缩、行动迟缓等一系列的症状表现。

感染后小鼠出现明显的体重下降，在感染后的第9天内，小鼠全部死亡，体重下降率接近30%，小鼠存活率和体重变化率。

2.小鼠模型感染病毒后在各组织中的分布及复制动力曲线

在小鼠感染H3N2病毒后第1-9d，安乐死小鼠，检测小鼠的肺、心、肝、脾、肾、肠、脑、眼、气管内的病毒复制情况，结果显示，在感染后不同的天数，肺、心、肝、脾、肾、肠、脑、眼、气管这些组织脏器当中能检测得到病毒载量。在感染后第2-5d肺和气管组织中病毒复制达到高峰，尤其是肺当中最高的滴度达到了105.5TCID50/ml。

3.小鼠模型感染病毒后组织病理改变

小鼠感染病毒后，分不同天数安乐死小鼠，取组织检测病理改变，结果显示，气管、心、肝、肾组织均未发现明显的病理变化。在感染后第1-5 d内，随着感染天数增加，肺组织病变区域逐渐增大，病变愈发严重。在感染后第1d，局部肺泡间隔轻度增宽，少数支气管上皮细胞变性坏死；在感染后第3d，肺泡间隔明显增宽，支气管上皮细胞变性坏死，肺泡内可见少量炎细胞渗出，血管周围水肿，少量出血；在感染后第5d，肺组织呈现间质性肺炎这一病毒感染引起的典型病理改变，肺泡间隔增宽程度增加，部分区域肺泡腔消失，炎细胞浸润，肺泡内可见较多的炎细胞及浆液纤维素渗出，支气管上皮细胞变性坏死，血管扩张充血；在感染后第7d，肺组织病变略有减轻，结果如图4所示。

免疫组织化学结果与HE染色结果大体一致。结果显示，在感染后第1-5 d内，抗原颗粒随着感染天数呈现增加的趋势。在感染后第1d，支气管上皮细胞呈现轻度阳性；在感染后第3d，支气管上皮细胞阳性增强，肺细胞内巨噬细胞呈现轻度阳性；在感染后第5d，支气管上皮细胞、肺细胞内巨噬细胞呈现出强阳性；在感染后第7d，支气管上皮细胞、肺细胞内巨噬细胞阳性程度降低。

4.小鼠模型感染病毒后细胞因子变化

小鼠感染病毒后，分别在感染后第3d和5d采血分离血清并收集肺泡灌洗液，利用微量样本多重蛋白定量技术（Cytometric Bead Array,CBA）对样本中炎性细胞因子的表达水平进行检测。结果发现，小鼠的血清内IL-1β、MCP-1、IL-1α、GM-CSF的表达升高。在病毒感染后第5天血清内IFN-γ的表达明显增加，结果。

小鼠肺泡灌洗液中细胞因子IL-1α、IL-6、IL-5、TNF-α、IFN-γ、IL-1β的表达明显升高，同时趋化因子MCP-1、GM-CSF的表达增加，尤其是MCP-1分泌水平急剧升高，并在感染后3天达到分泌高峰。

小鼠由于繁殖周期短、遗传背景均一、个体差异小等优点，被广泛用作流感病毒研究的动物模型，流感病毒在小鼠体内能否易感与相应受体有关。实验室所用的近交系和杂交系小鼠的呼吸道虽然都有所表达α-2,3和α-2,6两种唾液酸受体，但其中α-2,3交联唾液酸受体的数量占有优势。根据细胞表面受体分布的特点，小鼠通常只对禽流感病毒易感。而一些研究表明，小鼠能够突破受体限制性，对绝大多数的人流感、猪流感都能感染成功，但具有α-2,6交联唾液酸受体结合偏嗜性的野生型季节性流感病毒H3N2并不能直接成功感染小鼠。季节性流感病毒H3N2野生株虽不能直接感染小鼠，但国际上已建立有H3N2流感病毒小鼠感染模型，其大部分采用的是建立鼠适应株、反向遗传学技术构建整合毒株的方式，即从对病毒进行不断改造的角度进行构建。

病毒株为季节性流感病毒A/Aichi/2/68/H3N2经过小鼠体内7次传代后所获得鼠肺适应株，BALB/c小鼠经过轻度麻醉后滴鼻感染病毒，小鼠感染后观察14天，监测存活率及体重变化率。感染后分时间段安乐小鼠，分别在0、3、5d采血分离血清并收集肺泡灌洗液进行细胞因子检测；不同时间点取小鼠肺、脾、脑、心等组织，进行病毒滴度测定和组织病理学检查。

流感病毒是严重威胁人类健康的一种病原体，它能导致流感疫情甚至世界大流行，流感在各个年龄阶段的人群中都可能爆发而引起急性发热性呼吸道疾病。流感病毒为单股负链RNA病毒，属于正黏液病毒科，呈球形或丝状，直径80-120nm。病毒外层为两种不同糖蛋白构成的辐射状突起，即血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)。根据HA和NA抗原的不同,又可分为许多亚型，H可分为16个亚型，N有9个亚型(N1～N9)。H3N2亚型流感病毒1968年最早出现于香港，后传播到日本、美国等地，引发了一场流感世界大流行，致死人数达到近100万人。此后，虽未再次引起世界大流行，但散发流行至今。近年来，世界范围的流感流行病学监控和调查分析显示，该亚型流感病毒在仍是流行优势株，仅1968-1992年间我国发生的10次流感小流行中就有7次都是由H3N2流感病毒所引起，并且在1998年和2002年我国也都发生了较大范围的H3N2流感流行，其中北京市1998年11-12月的人群总发病率高达10%，总发病人数达到了100万以上。

疾病临床表现及致病机制

人感染H3N2流感病毒后，症状与普通人流感相似，临床表现包括发热（病毒感染发热一般是持续的，但下午较其他时间温度要高）、咳嗽、喉咙痛、身体疼痛、头痛、发冷和疲劳等，有些还会出现腹泻和呕吐，重者会继发肺炎和呼吸衰竭，甚至死亡。H3N2流感病毒传播速度快，人体对新变异病毒没有天然抗体。一般通过打喷嚏、咳嗽和物理接触方式传播。感染病毒的患者以青壮年为主，大多数年龄在25岁至45岁之间。由于个人免疫情况不一样，年轻人、儿童感染后，更容易出现流感样的症状，体温超过38℃，全身肌肉酸痛。老年人的反应就不会那么强烈，好多老年人感染后体温就不会很高，机体反应没有儿童敏感。

目前为广大学者接受的H3N2流感病毒致病机制主要有如下几种：①病毒诱导宿主细胞产生凋亡是其致细胞病变的重要机理之一；②病毒感染后对细胞造成的氧化应激损伤也是学者普遍接受的致病机制；③细胞因子风暴学说等其他学术学说和理论。以上3种机制相互联系，并且均与凋亡密切相关。

流感病毒感染机体后，可损害呼吸道上皮、肺上皮细胞，也可损伤肺外器官。不管在体内或体外流感病毒都可诱导宿主细胞凋亡，流感病毒诱导细胞凋亡可能是通过多条途径实现的，各条途径又互相联系，参与成分既有病毒的，也有细胞成分。整个过程由于多种细胞因子及病毒蛋白的参与而变得错综复杂。病毒感染引起宿主细胞凋亡损害宿主，但另一方面，宿主也通过这一方式限制病毒在机体内的增殖和扩散。病毒感染细胞后，若细胞迅速发生凋亡，则不利于病毒的繁殖。