H5N1滴鼻感染雪貂模型

到目前为止，已经报道有2种非人灵长类动物（恒河猴、食蟹猴）和4种啮齿类动物（大鼠、小鼠、田鼠、沙鼠），雪貂、家猫以及鸡、鸭等禽类可以作为H5N1禽流感病毒动物模型用于实验研究。低致病性H5N1禽流感病毒可以通过适应建立鼠肺适应株感染小鼠建立小鼠模型。非人灵长类动物通过鼻腔吸入较难感染，通常需要借助辅助器材进行定位感染，动物感染后体征变化不显著，肺组织出现局灶性病变。

前期研究显示雪貂的受体分布情况与人极为接近，呼吸气道长，上下呼吸道分腔明显是流感病毒研究最为理想的动物模型，缺点是雪貂受物种特异性限制缺乏相应的检测试剂。小鼠对多种流感病毒敏感，一直被选择作为流感病毒研究的动物模型，不仅有完备的检测试剂，还有相应的基因敲除、转基因小鼠可用于机制方面的研究。早期研究曾在多种非人灵长类动物中（非洲绿猴、Pata猴、猪尾猴、食蟹猴）检测到血清抗体阳性，并推测猴群感染病毒参与了流感大流行。研究发现非人灵长类动物感染禽流感病毒后的临床改变、病理变化、抗原分布都与人类存在一定差异，研究结果显示其对流感病毒敏感性较雪貂、小鼠低。至今没有直接证据表明非人灵长类动物的受体分布情况与人接近。恒河猴中研究局部肺组织损伤机制不仅与巨噬细胞有关，在研究抗补体机制中还应考虑PAMP的参与，NF-κB 等炎症信号途径的作用，这些研究在非人灵长类中受到一定限制，目前小鼠可以提供多方面抗补体机制研究。

1 受体比较

1) 人呼吸道上皮受体分布情况：α-2，6连接唾液酸糖蛋白受体主要分布在鼻粘膜上皮细胞, α-2，3连接唾液酸糖蛋白受体分布在鼻旁窦、咽、气管、细支气管上皮上。在终端呼吸性细支气管上皮细胞也表达α-2，6连接唾液酸糖蛋白受体。α-2，3连接唾液酸糖蛋白受体出现在呼吸细支气管与肺泡交界的无纤毛立方细支气管细胞上，部分肺泡壁细胞表达这种受体，这种细胞为肺泡Ⅱ型细胞。病人感染H5N1禽流感病毒后，病毒主要分布在肺泡Ⅱ型细胞内。

2) 雪貂除了气管中极少数杯状细胞既表达α-2，3SA受体又α-2，6SA受体，其上下呼吸道受体分布与人极为相似，小鼠多表达α-2，3SA受体，α-2，6SA受体较少，曾局限的认为小鼠较适合用于α-2，3SA受体结合的病毒研究，后有研究发现受体特异性并不影响某些病毒对小鼠的致病力和复制能力。

3)有研究显示通过体外实验证实非洲绿猴上皮细胞与人类流感病毒和禽类流感病毒都有较好的结合能力，与人类上皮细胞的结合能力接近。缺乏实验证据显示其受体与人类受体分布相似度。

2 感染途径比较

1) 小鼠、雪貂通过轻微麻醉后，以吸入式方式感染，感染方式与人极为接近。

2) 恒河猴、绿猴、食蟹猴等需要以环甲膜穿刺、支气管镜定位感染等方式进行感染，感染途径与自然感染途径差别较大，感染效果通常会出现肺组织局域性灶状感染，与吸入性感染方式产生的病变程度、范围存在一定差别。

3 感染后症状

1) 部分禽流感病毒在猴上皮细胞中复制受限或者发生不同程度的衰减。例如禽来源的H2N2病毒不能感染猴，H5N1高致病性禽流感病毒需要以高出雪貂感染剂量103倍的剂量感染猴，仍不致死，仅产生一过性体温升高。

2) 几乎所有禽流感病毒都能够在雪貂中成功复制，并产生临床可观察的改变，例如体温升高、体重下降、喷嚏、流涕、精神萎靡甚至死亡。

3)H5N1禽流感病毒感染小鼠后出现严重的肺炎，除呼吸道以外还在脑、脾、肝等组织中发现病毒抗原，并在脑组织中出病理改变，猴感染后在呼吸道以外的组织中未发现病毒抗原。

CRP基因敲除小鼠和人CRP转基因小鼠在赛业（苏州）生物科技有限公司模式动物研究中心完成，该中心具有符合国际标准的动物模型制备相关完备监督管理制度。动物的繁殖及感染模型评估在中国疾控中心动物中心完成，所有操作在SFP级别下遵守二级生物安全管理规定进行，实验动物尸体实行无害化处理，对生态环境无影响。

1.雪貂感染后临床表现

雪貂感染后出现体重下降，感染后第1天一直持续到实验结束，雪貂在感染后体重下降最高达15%以上，体重变化见图1A。雪貂感染后出现体温升高，与感染前比较体温最高上升2℃。感染后第2天出现体温升高，一直持续到实验结束（感染后第5天），体温变化见图1。

图1.雪貂感染后体重变化率%(A)；体温变化℃（B）。体重变化率%=（当天体重-0天体重）/0天体重*100%

雪貂感染然后显著的临床症状变化，根据其表现设立了评分标准：NIH提供的雪貂感染实验观察指标分为鼻部症状和活动度两个部分，具体指标见表1。

雪貂感染后出现以活动度下降为主临床改变，即表现为不活跃、对外界刺激的反应性下降，上呼吸道感染的症状如，打喷嚏、流鼻涕、呼吸困难等表现。感染后第5天1只雪貂死亡，被感染雪貂死亡前临床没有出现骤然体温升高、呼吸急促、呼吸困难等症状。雪貂感染后临床变化情况见图2。

2 感染雪貂组织病理损伤检查

雪貂感染H5N1禽流感病毒第5天后肺组织大体呈现多个肺叶腹侧面和背侧面出现片状灶状的坏死灶和出血灶，其他组织大体观察未发现明显异常。镜下观察发现肺组织呈炎性充血、出血、水肿、坏死、渗出的重度肺炎病理改变。大脑组织可见局灶性脑炎，血管周围炎细胞呈“套袖”装浸润，可见小灶状坏死。免疫组化染色可以观察到，尽管小肠组织没有观察到病变，在肺组织、脑组织、小肠组织均可以看到被病毒感染的阳性细胞。

对照组动物的肺（A）、大脑（D）、小肠（G）未见异常。感染组动物肺脏呈重度渗出坏死性肺炎改变，大量炎细胞、水肿液广泛渗出，可见坏死出血灶（B）；大脑组织可见局灶性脑炎，血管周围炎细胞呈“套袖”装浸润，可见小灶状坏死（E）；小肠组织未见异常（H）。免疫组化显示感染动物的肺（C）、大脑（F）、小肠（I）均可见大量感染病毒的细胞。A、B、D、E、G、H：HE×100；C、F、I：IHC×200

3 感染雪貂组织中病毒复制动力曲线

雪貂感染后，每天取鼻甲骨活检物做病毒滴度测定，结果显示雪貂在感染后第1-5天都检测到病毒，病毒滴度为102.3-103.8 TCID50。病毒滴度检测表明雪貂在感染后上呼吸道呈持续复制趋势。上呼吸道病毒复制结果见表2。

雪貂在感染后第5天安乐处死，取雪貂气管、肺、心、肝、脾、肾、小肠、脑组织做病毒滴度测定。结果显示各个组织都能够分离到病毒，其中以气管和肺组织的病毒滴度最高，病毒分离的阳性率为13/24。以上的结果反映了H5N1病毒感染雪貂，呼吸系统的器官是病毒侵袭的重要对象，呼吸系统以外的器官也会受到病毒的攻击，并且病毒可以突破血脑屏障感染脑组织，这就解释了为什么感染禽流感病毒病人会出现多系统多器官受损和出现神经系统的症状。各组织脏器病毒滴度结果见表3。

雪貂呼吸道解剖结构上下呼吸道分腔明显，受体分布与人极为接近，是迄今为止最为敏感的流感病毒感染动物模型。它对人流感病毒高度易感，病毒不经适应即能使雪貂致病，并易传播给雪貂和人。在自然条件下，雪貂一般也是通过呼吸道吸入病毒的方式感染流感病毒，其感染后的发病过程和机体反应也与人体相似。雪貂除对人流感病毒高度易感外，对禽流感、猪流感病毒也十分敏感，且感染后出现典型症状。

去势雪貂（Mustela Pulourius Furo），4-10月龄，500-1000克。 实验前进行血清学检查，HI方法检测H1N1，H5N1抗体，抗体阴性为合格雪貂方可入组实验。

该研究项目在BSL-3 实验室中进行。病毒株为H5N1 A/ Vietnam/1203/2004，雪貂经过轻度麻醉后滴鼻感染病毒。实验的观察期为5天。皮下植入体温芯片用于监测体温、体重变化。每日观察雪貂临床症变化，在感染后第5天处死动物，取组织样本用于监测病毒复制动力曲线和动物感染后组织炎症反应检查。

禽流感依据其对禽类的致病能力大小可以分为三个程度：高致病性、低致病性和无致病性。其中高致病性禽流感包括H5和H7 两个亚型。但并非所有的H5 和H7 都是强毒株。人高致病性禽流感是由高致病性禽流感病毒某些亚型的毒株引起的人急性呼吸道传染病。由H5N1亚型禽流感引起的症状较重，病死率高。1997年，香港一名3岁的男童因感染禽流感而死亡，在随后的几个月中，共有18个人感染禽流感病毒，其中6人死亡。之后相继有 H9N2、H7N7 亚型禽流感感染人类和 H5N1 亚型再次感染人类的报道,禽流感与人禽流感的关系开始倍受关注。2003年12 月中旬开始至今,朝鲜、越南、泰国、韩国、日本和中国等10 余个亚洲国家先后暴发H5N1高致病性禽流感疫情, 并且再越南、泰国、柬埔寨以及印度尼西亚出现了人感染高致病性禽流感病毒病例。据最新资料报道，世界卫生组织已证实泰国、越南和柬埔寨以及印度尼西亚自2004年1月起截至到2005年8月20日共有112人感染，其中导致57人死亡。而H7N7感染引起的症状相对较轻仅以眼角结膜炎和轻微的呼吸道症状为主。追溯历史，有报道的第一次禽流感感染人的事件发生在上个世纪的70-80年代的几例以自限性结膜炎为临床特征的H7N7感染病患。最近的一次发生在2003年荷兰一家农场有近80名工人及家属被确诊为H7N7感染,他们以眼部感染和呼吸道症状为主,其中一名兽医死亡,他的家人未接触病禽但也被证实H7N7感染。这起事件具有有限的人传人的证据。

禽流感病毒感染患者临床表现及致病机制

H5N1禽流感病毒感染的潜伏期一般为2～4天，平均3天。发病前1天就开始排毒，排毒时间儿童比成人长，免疫抑制者排毒可长达一个多月。临床表现为急性起病，早期表现类似一般流感。主要为发热，体温大多持续在38℃以上，热程1～7天，一般为3～4天，可伴有流涕、鼻塞、咳嗽、咽痛、头痛和浑身不适。少数患者可有恶心、腹泻、稀水样便等症状。重症患者病情发展迅速，可出现肺炎、急性呼吸窘迫综合征、肺出血、胸腔积液、全血细胞减少，肾功能衰竭，败血症、休克及Reye综合征等多种并发症。