H7N9滴鼻感染BALB/c小鼠模型

到目前为止，已经报道有2种非人灵长类动物（恒河猴、食蟹猴）和4种啮齿类动物（大鼠、小鼠、田鼠、沙鼠），雪貂、家猫以及鸡、鸭等禽类可以作为H5N1禽流感病毒动物模型用于实验研究。低致病性H5N1禽流感病毒可以通过适应建立鼠肺适应株感染小鼠建立小鼠模型。非人灵长类动物通过鼻腔吸入较难感染，通常需要借助辅助器材进行定位感染，动物感染后体征变化不显著，肺组织出现局灶性病变。

前期研究显示雪貂的受体分布情况与人极为接近，呼吸气道长，上下呼吸道分腔明显是流感病毒研究最为理想的动物模型，缺点是雪貂受物种特异性限制缺乏相应的检测试剂。小鼠对多种流感病毒敏感，一直被选择作为流感病毒研究的动物模型，不仅有完备的检测试剂，还有相应的基因敲除、转基因小鼠可用于机制方面的研究。早期研究曾在多种非人灵长类动物中（非洲绿猴、Pata猴、猪尾猴、食蟹猴）检测到血清抗体阳性，并推测猴群感染病毒参与了流感大流行。研究发现非人灵长类动物感染禽流感病毒后的临床改变、病理变化、抗原分布都与人类存在一定差异，研究结果显示其对流感病毒敏感性较雪貂、小鼠低。至今没有直接证据表明非人灵长类动物的受体分布情况与人接近。恒河猴中研究局部肺组织损伤机制不仅与巨噬细胞有关，在研究抗补体机制中还应考虑PAMP的参与，NF-κB 等炎症信号途径的作用，这些研究在非人灵长类中受到一定限制，目前小鼠可以提供多方面抗补体机制研究。

受体比较

1) 人呼吸道上皮受体分布情况：α-2，6连接唾液酸糖蛋白受体主要分布在鼻粘膜上皮细胞, α-2，3连接唾液酸糖蛋白受体分布在鼻旁窦、咽、气管、细支气管上皮上。在终端呼吸性细支气管上皮细胞也表达α-2，6连接唾液酸糖蛋白受体。α-2，3连接唾液酸糖蛋白受体出现在呼吸细支气管与肺泡交界的无纤毛立方细支气管细胞上，部分肺泡壁细胞表达这种受体，这种细胞为肺泡Ⅱ型细胞。病人感染H5N1禽流感病毒后，病毒主要分布在肺泡Ⅱ型细胞内。

2) 雪貂除了气管中极少数杯状细胞既表达α-2，3SA受体又α-2，6SA受体，其上下呼吸道受体分布与人极为相似，小鼠多表达α-2，3SA受体，α-2，6SA受体较少，曾局限的认为小鼠较适合用于α-2，3SA受体结合的病毒研究，后有研究发现受体特异性并不影响某些病毒对小鼠的致病力和复制能力。

3)有研究显示通过体外实验证实非洲绿猴上皮细胞与人类流感病毒和禽类流感病毒都有较好的结合能力，与人类上皮细胞的结合能力接近。缺乏实验证据显示其受体与人类受体分布相似度。

6.2感染途径比较

1) 小鼠、雪貂通过轻微麻醉后，以吸入式方式感染，感染方式与人极为接近。

2) 恒河猴、绿猴、食蟹猴等需要以环甲膜穿刺、支气管镜定位感染等方式进行感染，感染途径与自然感染途径差别较大，感染效果通常会出现肺组织局域性灶状感染，与吸入性感染方式产生的病变程度、范围存在一定差别。

感染后症状

1) 部分禽流感病毒在猴上皮细胞中复制受限或者发生不同程度的衰减。例如禽来源的H2N2病毒不能感染猴，H5N1高致病性禽流感病毒需要以高出雪貂感染剂量103倍的剂量感染猴，仍不致死，仅产生一过性体温升高。

2) 几乎所有禽流感病毒都能够在雪貂中成功复制，并产生临床可观察的改变，例如体温升高、体重下降、喷嚏、流涕、精神萎靡甚至死亡。

3)H5N1禽流感病毒感染小鼠后出现严重的肺炎，除呼吸道以外还在脑、脾、肝等组织中发现病毒抗原，并在脑组织中出病理改变，猴感染后在呼吸道以外的组织中未发现病毒抗原。

CRP基因敲除小鼠和人CRP转基因小鼠在赛业（苏州）生物科技有限公司模式动物研究中心完成，该中心具有符合国际标准的动物模型制备相关完备监督管理制度。动物的繁殖及感染模型评估在中国疾控中心动物中心完成，所有操作在SFP级别下遵守二级生物安全管理规定进行，实验动物尸体实行无害化处理，对生态环境无影响。

1.小鼠模型感染后临床症状变化

小鼠感染H7N9病毒后的存活情况如图1A所示，其中接种106 TCID50病毒的小鼠14天内全部存活，而107或108 TCID50病毒对小鼠的致死率分别达20%和60%。小鼠感染106 TCID50病毒后，第2天开始出现体重下降的现象，第9天体重降至最低，仅为攻毒前的71.1%，随后体重便逐渐上升直至完全恢复（图1B及表1）。此外，部分小鼠感染后第3天开始出现竖毛现象，第4天时所有小鼠均出现并持续至感染后第14天（图2及表1）。

出现该临床表现的动物数量占总观察数量的比例。

2. 小鼠模型感染后病毒在组织中复制情况

接种106 TCID50病毒的小鼠在感染后1，2，3，5，7天各安乐解剖6只，来分析病毒的组织分布。从感染后第1天至第7天，小鼠的支气管肺泡灌洗液（BALF）及肺组织均可检测到排毒，其中BALF排毒的峰值出现在感染后第1天（103.75 TCID50/ml），而肺组织的排毒峰值出现在感染后第2天（105.69 TCID50/g）（图3及表2）。除呼吸道外，病毒还可从小鼠的脑、肝、脾、肾、和小肠中检出（表2）。

病毒检测阳性的动物数量占总解剖动物数量的比例。

3.小鼠模型感染后组织病理损伤

免疫组织化学（IHC）检测发现病毒抗原主要分布于肺支气管上皮细胞、脑脉络丛、小肠绒毛柱形细胞、以及肾小管内（图4 (i-iv)）。H-E染色结果证实从感染后第1天起，肺组织即呈现出典型的流感病毒感染的病理表现，包括炎性充血和渗出性病理改变等等。感染后3-7天，肺组织病变面积进一步扩大，并发展为重度间质性肺炎（图4 (v-viii)）。

4. 小鼠模型感染后血清特异性抗体产生情况

感染后第14天，对存活小鼠的眼眶静脉丛血清进行血凝抑制实验（HI），测定对H7N9病毒的特异性抗体效价，结果证实所有小鼠均出现抗血清转阳，对H7N9病毒的HI效价达80-160。

5. 小鼠模型感染后血常规检测结果

临床研究证实，患者感染H7N9病毒后，会出现显著的白血球减少症。在小鼠模型中，我们同样观察到这一现象。与小鼠感染前相比，接种H7N9病毒后第2-7天，小鼠的白细胞总数出现了显著下降（P<0.05）。感染后第2天，还可见显著降低的淋巴细胞和显著升高的中性粒细胞（P<0.05）（表3）。

白细胞总数，表示为每微升外周血中103 白细胞数量。

小鼠由于繁殖周期短、遗传背景均一、个体差异小等优点，被广泛用作流感病毒研究的动物模型，不仅有完备的检测试剂，还有相应的基因敲除、转基因小鼠可用于机制方面的研究。小鼠多表达禽源流感病毒α2,3SA受体，人源流感病毒α2,6SA受体较少，曾局限的认为小鼠较适合用于α2,3SA受体结合的流感病毒研究，后有研究发现受体特异性并不影响某些病毒对小鼠的致病力和复制能力。

制作流感病毒感染动物模型多应用SPF级雌性BALB/c小鼠，4-6周龄。

病毒株为A/Anhui/1/2013 (H7N9)，BALB/c小鼠经过轻度麻醉后滴鼻感染病毒。小鼠感染后观察14天，监测存活率及体重变化率。感染后分时间段安乐小鼠，每个时间点收集相同数量小鼠肺、脾、脑、心等组织，进行病毒滴度测定和组织病理学检查。

2013 年3月31日，依据《国际卫生条例（2005）》，中国政府报告上海和安徽发现3例人感染新型甲型H7N9禽流感病毒（以下简称H7N9）病例。在随后的几个月内，以华东地区为代表的我国多个省市陆续确诊并报道多例H7N9禽流感病毒感染人造成重症肺炎甚至死亡的病例，这是世界首次发现的新型重配H7N9禽流感病毒所致的人感染疫情，引起了广泛关注。

H7N9禽流感病毒是由H7 的HA 基因，N9 的NA 基因以及H9N2 病毒的6 个内部基因片段重配而成的新型病毒。对目前已公布了全基因组的若干H7N9禽流感患者分离株的序列分析结果显示，该病毒具有与之前其他亚型甲型流感病毒类似的遗传特征，包括对禽类低致病性，感染哺乳动物的能力增强，对金刚烷胺类抗病毒药物耐药，以及对神经氨酸酶抑制剂（如奥司他韦和扎那米韦）敏感。

人感染H7N9禽流感病毒后，临床表现包括发热、咳嗽、呼吸困难、乏力、肌肉酸痛、咯血及胃肠道症状，初始症状并不包括鼻塞和流涕。97%的患者出现肺炎，超过70%的患者发生急性呼吸窘迫综合症（ARDS），部分患者继而进展为顽固性低氧血症和多器官功能衰竭并导致最终死亡。少数病例为轻症，均为儿童，常常仅有发热表现。实验室检测结果显示，患者外周血白细胞正常或减少，淋巴细胞减少，血小板缺乏，以及肝酶轻度升高。约60%的病例具有各种并发症，如冠心病、糖尿病、高血压和慢性阻塞性肺病。病例以老年人（平均年龄62岁）和男性（69%）居多。

研究显示，活禽市场是人感染H7N9 禽流感病毒的可能来源。活禽暴露是人感染的关键风险因素，导致患者感染的主要暴露方式为直接接触染毒的活禽、被其排泄物污染的环境或物品。然而，目前从不同患者体内分离到的病毒株基因组序列存在一定的差异，其进化源头似乎并不相同，因此目前报道的这些病例极有可能是一些独立的感染事件。流行病学调查也为这一论点提供了部分佐证。目前已确诊的人感染病例多为散发，彼此间没有明显的流行病学关联。尽管如此，目前仍有三起疑似家庭聚集案例的报道。

基因进化分析显示，H7N9 禽流感病毒是一种新型重配病毒。虽然各基因片段分别与近期东亚地区流行的禽流感病毒同源性较高，但这种基因组成之前从未在禽、人或其他动物中发现过。其HA 基因可能源于我国长三角地区鸭群中的H7 亚型禽流感病毒，NA基因的来源目前尚无定论，早期研究认为其源于欧亚迁徙的候鸟，最新研究则指出它与2010-2011年间途径香港境内的候鸟分离到的H11N9和H2N9病毒高度同源。尽管如此，目前无异议的一致的结论是，野鸟在H7N9 禽流感病毒传播中可能扮演重要角色，鸭群则在将H7N9相关病毒从野鸟传至家禽的过程中，起到至关重要的中间宿主作用。