MERS-CoV气管镜途径感染绒猴模型

1、MERS-CoV感染绒猴临床观察

狨猴经气管插管辅助攻毒后，狨猴表现了明显的感染症状，引起了中度或重度的呼吸道症状，甚至出现死亡。主要表现为呼吸频率增加，活动减少，身体蜷缩，饮食量减少，体重降低。特别是攻毒组有两只狨猴症状更明显。攻毒后3天内狨猴体温下降，白细胞数减少，红细胞数变化不明显。对照组狨猴无任何临床。

2、MERS-CoV感染绒猴病理学检查

MERS-CoV感染前和感染后1天和3天分别进行了肺部X光拍摄，感染前肺部并未观察到任何变化，感染1天时肺右下出现阴影，表明肺部有炎症反应。3天时阴影面积有所增大（图2A）。感染3天时，对剩余的1只攻毒狨猴进行了CT拍摄，发现了肺部出现片状低密度影，跟X光拍摄结果类似（图2B）。攻毒两天后，1只狨猴死亡，一只执行安乐死，大体解剖可见肺部有大面积充血呈暗红色。剩余1只狨猴于感染后3d执行安乐死，大体解剖亦可见肺部有不同程度充血呈暗红色，其位置跟X光和CT检查结果一致（图2C）。而对照组肺部无明显变化。显微病理检查可见攻毒组狨猴各个肺叶均发生多灶性到融合性渗出性肺炎，肺泡中可见大量渗出的炎性细胞（巨噬细胞、嗜中性粒细胞和淋巴细胞为主）和纤维素，并发生肺水肿，局灶肺泡隔显著增宽，肺泡结构消失，血管扩张充血，周围可见大量炎性细胞浸润，出血（图3）。另外肾脏肾小球毛细血管扩张充血，少量肾小管上皮细胞不同程度变性坏死，有的管腔中可见蛋白管型形成（图3）。而对照组无此变化。其它组织未见明显的病理改变。免疫组化分析表明攻毒组狨猴肺和气管中可检测到病毒蛋白的表达，阳性细胞主要分布在Ⅰ型肺泡细胞和巨噬细胞。肺外器官并未检测到病毒蛋白的存在。对照组猴肺中并未检测到病毒特异蛋白的存在（图4）。

3、qRT-PCR方法检测拭子和组织样品病毒载量

攻毒后分别对拭子样品和组织样品进行病毒核酸检测，结果发现攻毒组3只狨猴均可在肺部和气管检测到病毒核酸存在。攻毒两天后死亡的两只狨猴还在心脏、肝脏、脾脏和肾脏检测到病毒核酸的存在，表明存在病毒血症的可能性。而另一只狨猴并未在肺外组织检测到病毒核酸的存在。采集的拭子样品进行病毒核酸检测，结果显示在攻毒狨猴的肛拭子中均未检测到病毒核酸。死亡的2只狨猴均可在攻毒1天时的咽拭子中检测到病毒，但其中仅有一只在鼻拭子中检测到病毒核酸。攻毒组另外1只狨猴在鼻拭子和肛拭子并未检测到病毒核酸。对照组狨猴组织和拭子样品未检测到病毒核酸的存在（表1）。

4、 拭子和组织样品中病毒滴度测定

对采集的鼻拭子、咽拭子、肛拭子在Vero细胞上进行病毒滴度测定，仅有1只狨猴在攻毒1天时的咽拭子中检测到病毒，滴度可达103TCID50/ml，该狨猴在攻毒两天后死亡。其它拭子样品并未分离到病毒。采集的组织样品进行病毒分离，只在肺部和气管分离到较高滴度的病毒。其他器官（肾脏、心脏、肝脏、脾脏）并未分离到病毒（图5）。对照组狨猴拭子和组织样品也未分离到病毒。

5、狨猴肺部电镜观察

对感染MERS-CoV病毒的肺组织进行透射电镜观察，结果发现在其胞浆中可观察到病毒颗粒（图6），进一步证实病毒可在肺细胞中复制。

实验用狨猴，3-4 岁，雄性，遗传背景明确。按照国家微生物和寄生虫SPF等级通过检测，抗MERS抗体阴性。绒猴在生物安全三级（BSL-3）实验室内饲养，并按国家动物生物安全标准操作规程进行操作。

MERS-CoV(hCoV-EMC，GenBank: MH454272.1）由荷兰伊拉斯姆斯大学医学中心Ron Fouchier 教授馈赠。采用支气管镜辅助攻毒，攻毒剂量为

6.5×106TCID50/1ml/只。

观察攻毒后绒猴临床症状，每天两次。分别于攻毒前1d和攻毒后3d进行胸部X光拍摄。攻毒后随时观察狨猴状态，一旦评分超过35 分，即进行人道主义安乐死。采集肺、气管、心、脾、肾、脑、肝脏、肠组织进行病理、免疫组化和病毒检测。攻毒后分别在1, 3 天采集咽拭子、鼻拭子、肛拭子进行病毒检测。

2012 年6 月埃及病毒学家Zaki 从沙特一位患有急性肺炎并伴发急性肾衰竭的男性患者中分离到了一株冠状病毒。随后他把病毒样本送到了荷兰鹿特丹伊拉斯姆斯大学医学中心（Erasmus Medical Center），Ron Fouchier 教授最终证实的确是一种以前没有见过的冠状病毒，命名为 HCoV-EMC，是一种不同于SARS 冠状病毒(SARS-CoV)的新型冠状病。

随后英国的科学家也确认了一名来本国就医的卡塔尔患者也感染了这种新型冠状病毒，症状亦是严重呼吸综合征，将该病毒命名为人冠状病毒-England 1( human coronavirus England 1)。后续经证实两病例感染的病毒为同一病毒，序列比对有99.5%的相似性。

2012 年9 月23 日，世界卫生组织发布公告，确认有2 名患者感染了新型冠状病毒，两人临床表现为急性呼吸道感染，并伴有急性肾衰竭。此后几个月该病毒在中东地区接连出现，并出现了小群体传播事件。另外一些欧洲、美洲、非洲国家也出现来自中东的输入病例，分离的毒株也越来越多，并各自命名，比如humanbetacoronavirus 2CJordan-N3、humanbetacoronavirus 2c England-Qatar 等。为统一新型冠状病毒名称，方便新型冠状病毒感染病例的通报，2013 年5月国际病毒分类委员会冠状病毒研究小组将此新型冠状病毒命名为中东呼吸综合征冠状病毒(Middle East respiratory syndrome coronavirus, MERS-CoV)。

据WHO 报道该病的潜伏期为2-15 天。临床表现以急性呼吸道感染为主要症状。发病快、高热、体温可达39-40℃，伴有畏寒、寒战，咳嗽、胸痛、头痛、全身肌肉关节酸痛、乏力、食欲减退等症状。在肺炎基础上，临床病变进展迅速，很快发展为呼吸衰竭、ARDS 或多器官功能衰竭（MODS），特别是肾功能衰竭，危及生命，少数病例病情相对较轻。患者还可能出现消化道症状，如腹泻和胃部不适等；有些患者还会发生脓毒性休克，导致死亡。免疫力低下、老年人和伴有慢性病（如糖尿病、癌症和慢性肺部疾病）的人群更易发展为重症。

影像学表现：胸部X 光片的结果和局限性肺炎、ARDS 的结果一致，如双侧肺门浸润，单侧或双侧片状增厚、分割或肺叶混浊，毛玻璃样外观，胸膜积液等。下部肺叶比上部肺叶受损程度更大。CT 扫描则显示间质性浸润和实病。患者通常表现为白细胞减少，尤其是淋巴细胞减少。另外患者的血、尿及粪便中均能检测到病毒RNA，但远少于呼吸道内的病毒量，且上呼吸道中的病毒量通常也比下呼吸道量少。在一些病患中发现有其它呼吸道病毒共感染，在机械通气的病患中也出现医院获得性细菌感染。