结核分枝杆菌感染小鼠模型

该模型的主要评价指标为不同感染期的肺脾肝荷菌量和病变评分值，该模型与国内外报道的经典cornell模型类似，但是cronell模型的问题在于模型潜伏期荷菌量过高，复发期3-9个月后不等。本模型不断的摸索尝试克服以上问题，模型均一，参数指标稳定，各感染期的荷菌量值水平合适（不过低也不过高），周期明显缩短，由3-9个月不等的周期缩短到比较稳定的10周，便于应用。

该模型不仅可以用于潜伏及复发的早期诊断分子的研究，还可以利用潜伏及复发期研究疾病机制，同时可以用于评价潜伏感染的预防性抗生素效果，以及治疗性疫苗的效果。

动物模型的制备的设计得到研究所IACUC委员会的批准，人员都是训练有素的研究人员和实验人员，全程在ABSL-3实验室中进行，完全按照模型制备和检测的一系列SOP操作进行，遵守生物安全操作要求，无安全事故。

1小鼠体重的变化结果

根据十周连续观察体重后，统计数据可以看出三个实验组中的对照组小鼠体重按照正常的规律增加，即从实验开始的18~20g到感染第10周后的21~22g左右；实验感染小鼠的体重均有不同程度的下降。

感染途径的不同体重变化的情况随之不同，C57BL/J小鼠尾静脉注射组和腹腔注射组的体重均在感染后第7周开始下降，其中尾静脉注射下降幅度较大。BALB/c小鼠体重下降是从感染后第6周开始下降。

感染剂量的不同体重变化也有较大的变化，感染剂量为105CFU的小鼠体重变化，C57/BL/J是尾静脉感染后第7周开始有明显下降（约3g左右），C57/BL/J是腹腔感染后体重下降的幅度较小在1g左右，BALB/c小鼠体重下降是从感染后第6周开始下降。感染剂量为104CFU、103CFU体重还是在上升，与对照组比较没有明显区别。

体重变换曲线见图1、2：

图1 C57BL/6小鼠尾静脉注射感染结核分支杆菌后体重变化曲线

图2BALB/c小鼠尾静脉注射感染结核分支杆菌后体重变化曲线

2 小鼠感染后大体病理变化

感染后6周解剖时病理变化，与对照组相比，各组小鼠的脾脏肺脏均没有眼观变化。

小鼠在感染8周时，不同品系小鼠和不同剂量组的小鼠在肺脏和脾脏均有不同程度的眼观病理变化。解剖发现主要在肺脏有不同程度秫米大小的结核病灶，且脾脏肿大。小鼠感染8周后解剖病理变化：BABL/c和C57BK/J对照组小鼠均未发现肉眼可见的病理变化。BABL/c和C57BK/J小鼠的尾静脉注射组均有肉眼可见病变灶。C57BK/J小鼠的腹腔注射组没有肉眼可见的病理变化。8周时，与对照组相比，BABL/c小鼠的低剂量组103、104、105肺脏均已经有病理变化，脾脏出现肿大;C57BK/J小鼠低剂量组没有变化，104、105肺脏均有病理变化，且脾脏没有变化。

小鼠感染10周后解剖病理变化：BABL/c和C57BK/J对照组小鼠均未发现肉眼可见的病理变化。与对照组相比，BABL/c和C57BK/J小鼠的尾静脉注射组103、104、105均有肉眼可见病变灶。C57BL/J小鼠的腹腔注射组在10周时也出现了肉眼可见的病理变化。10周时，与对照组相比，BABL/c小鼠的103、104、105各剂量组肺脏均已经有严重的病理变化，有粟粒样结核结节且主要特点是分布在全肺不同的部位，脾脏出现肿大也是一个主要的病理变化指标；C57BL/J小鼠103、104、105肺脏也均出现了病理变化，也有粟粒样结核结节，但主要分布在肺叶的边缘。脾脏与对照组相比，没有明显的变化。

结果见图3、4：

图3 对照组小鼠解剖眼观肺脏病理变化

CW:c57小鼠BW:BABL/c

图4C57BL/6小鼠尾静脉注射感染结核分支杆菌后解剖眼观肺脏病理变化

3小鼠的组织病理变化

正常对照组的肺脏和脾脏未见明显病理改变。10^{4CFU、105CFU、106CFU组内均有不同程度肺组织内血管旁淋巴细胞浸润，肺组织内肉芽肿，脾脏肉芽肿，肝组织内肉芽肿。结果见图5}

图5 小鼠病理切片HE染色结果

A:正常肺脏；E:正常脾脏；B:肺组织内血管旁淋巴细胞浸润 C: 肺组织内肉芽肿；F: 脾脏肉芽肿；G: 肝组织内肉芽肿

4 小鼠荷菌量变化

感染后6周时，解剖小鼠肉眼观察，脾脏、肺脏均没有明显肉眼可见的病变灶。每组的正常对照组均无结核分支杆菌生长，对照组实验结果成立。6周解剖脾脏细菌分离培养均有结果（除去C57BL/J小鼠腹腔注射104有一只为阴性）。证明以103为感染剂量尾静脉注射均可在6周时感染BABL/c、C57BL/J小鼠。脾脏细菌分离培养结果见下表1：

感染后8周时，解剖后对照组小鼠肉眼观察，脾脏、肺脏均没有明显肉眼可见的病变灶，每组的正常对照组均无结核分支杆菌生长，对照组实验结果成立。但8周解剖时，在C57BL/J尾静脉注射组104、105组已经在肺脏和脾脏出现眼观的病理变化，BABL/c小鼠尾静脉注射组103、104和105组均在肺脏和脾脏出现眼观的病理变化。但8周解剖脾脏细菌分离培养均有结果（除去BABL/c小鼠尾静脉注射104和C57BL/J腹腔注射组103各有一只为阴性）。证明以103为感染剂量尾静脉注射均可在8周时感染BABL/c、C57BL/J小鼠，腹腔注射可感染BABL/c小鼠。细菌分离培养显示组织荷菌量高于6周。

感染后10周时，解剖后对照组小鼠肉眼观察，脾脏、肺脏均没有肉眼可见的病变灶，每组的正常对照组均无结核分支杆菌生长，对照组实验结果成立。在C57BL/J尾静脉注射组104、105、106组已经在肺脏和脾脏出现眼观的病理变化，BABL/c小鼠尾静脉注射组104和105、106组均在肺脏和脾脏出现眼观的病理变化，C57BL/J腹腔注射组104、105、106组已经在肺脏和脾脏出现眼观的病理变化。细菌分离培养结果显示组织荷菌量高于8周。

表1 小鼠感染结核分支杆菌后6周脾脏细菌的分离培养结果

1实验用小鼠的选择：

选择年龄6~8周龄，体重16~20g，SPF级雌性C57BL/6和BALB/c小鼠（提供厂商:中国医学科学院实验动物研究所）。动物使用申请号:中国医学科学院实验动物研究所实验动物管理委员会（批准号：MC—09-2003）。

2饲养环境：

动物生物安全3级实验室（ABSL-3）；温湿度范围：18-28℃；相对湿度：40-70％；换气次数：机械送排风；明暗周期：12h/12h；照度：150-300Lux；清洁消毒：用具、笼架等在投入使用前进行消毒；笼具种类及饲育密度：小鼠笼，12只一笼；

3饲养条件

中国医学科学院实验动物研究所华阜康有限公司小鼠专用饲料,自由采食；垫料为中国医学科学院实验动物研究所华阜康有限公司，定期更换；饮水；普通自来水经过高压(121℃,30min)，自由饮用。

4实验用小鼠的分组及感染

实验共分为三个大组，第一组为C57BL/6尾静脉注射组、第二组为C57BL/6腹腔注射组和第三组为BALB/c尾静脉注射组，其中每一个大组中分四个小组：正常对照组(生理盐水)、高剂量组（1X10^{6CFU）、中剂量组（1X105 CFU）和低剂量组（1X104 CFU），每组12只小鼠，共144只小鼠。}

5感染用菌株

用结核分支杆菌标准菌株H37Rv株或结核耐药株（内部编号94789）。

6观察

小鼠在进入ABSL-3实验室之后,观察4~5天后,进行感染实验。感染后，观察每天感染小鼠的临床症状，并每周称取小鼠体重，观察不同感染方式和不同感染剂量小鼠体重的变化规律。

7病理检查和组织荷菌量计数

分别在感染后6周、8周和10周，每组解剖3只小鼠，分别无菌取小鼠1/2脾脏、1/2肺脏，无菌研磨后接种L-J斜面进行结核分支杆菌的分离培养。并将同一组织的剩余部分固定在10%福尔马林中，进行病理切片。

结核病是由结核分支杆菌（结核菌）引起的一种慢性传染性疾病，结核感染通常会累及肺、淋巴系统及其它多组织器官。除少数发病急促外，临床上多呈慢性过程。常有低热、乏力等全身症状和咳嗽、咯血等呼吸系统表现。感染后潜伏期4～8周，其中80%发生在肺部，其他部位（颈淋巴、脑膜、腹膜、肠、皮肤、骨骼）也可继发感染。

排菌的肺结核患者是传染源,人与人之间呼吸道传播是本病传染的主要方式。大多数的受感染者没有病症，称为潜伏结核感（latentTBinfection），但其中约5-10%的潜伏感染者会发展至活动性结核；若无适当治疗，一个活动病例平均每年可使10～15人新受感染，病例本人的死亡率则超过50%。若潜伏感染者同时罹患免疫抑制，如艾滋病，每年就有10%的病发机率。

肺结核病程较复杂，临床分型有：1、原发型肺结核(Ⅰ型): 肺内渗出病变、淋巴管炎和肺门淋巴结肿大的哑铃状改变的原发综合征。儿童多见，仅表现为肺门和纵隔淋巴结肿大。 2、血型播散型肺结核(Ⅱ型):包括急性血型播散型肺结核及亚急性、慢性血型播散型肺结核。 3、继发型肺结核(Ⅲ型):可以出现以增殖为主、浸润为主、干酪病变为主或以空洞为主等多种病理改变。

结核菌进入机体后，被巨噬细胞吞噬，结核菌毒力与宿主免疫力的抗衡决定着结核发病、发展和转归。结核病从感染、发病到转归均与多数细菌性疾病有显著不同，宿主反应具有特殊意义，反应分为4期：1.起始期，入侵呼吸道的结核菌被肺泡巨噬细胞吞噬。因菌量、毒力和巨噬细胞非特异性杀菌能力的不同，被吞噬结核菌的命运各异。2.T细胞反应期，由T细胞介导的细胞免疫（CMI）和迟发性过敏反应（DTH）在此期形成，从而对结核病发病、演变及转归产生决定性影响。3.共生期，大部分感染者结核菌可以持续存活，细菌与宿主处于共生状态。纤维包裹的坏死灶干酪样中央部位被认为是结核杆菌持续存在的主要场所。低氧、低PH和抑制性脂肪酸的存在使细菌不能增殖。宿主的免疫机制亦是抑制细菌增殖的重要因素，倘若免疫损害便可引起受抑制结核菌的重新活动和增殖。4.细胞外增殖和传播期，固体干酪灶中包含具有生长能力、但不繁殖的结核菌。干酪灶一旦液化便给细菌增殖提供了理想环境。即使免疫功能健全的宿主，从液化干酪灶释放的大量结核杆菌亦足以突破局部免疫防御机制，引起播散。

结核病的全身症状是全身乏力、午后低热、盗汗、食欲不振、消瘦等；呼吸道症状是咳嗽、咳痰、咯血、胸疼、呼吸困难等。其特征性病理改变是肉芽肿病变和结核性结节，其基本病理变化为渗出性病变、增生性病变和坏死性病变。渗出性病变以炎症细胞、单核细胞肌纤维蛋白为主要成分，增殖性改变以结核结节及结合性肉芽肿为主，坏死的特征性改变为干酪样改变。结核性炎症的主要特是上皮样细胞结节及郎格汉斯细胞。实验室痰培养为菌阳性，抗酸染色可见细长略弯曲的杆菌，血沉加快。肺的原发病灶、淋巴管炎和肺门淋巴结结核合称为原发综合症，X线影像学上的典型表现为哑铃状阴影。感染3-8周后结核菌素皮试转阳，95%的健康感染者原发综合征自然消退，成为潜伏感染人群，约5%在日后因潜在感染复燃而发病,结核病起病缓慢，病程较长。