Leptin敲除肥胖症大鼠模型

该模型通过长期观察普通狼疮小鼠模型，待其到40周龄时，检测其dsDNA等，结合皮肤症状变化，来确定慢性狼疮皮肤病模型的建立。目前国际上尚欠缺类似模型，为研究狼疮皮肤病发病机制提供了工具。

模型动物饲养在武汉大学人民医院动物房SPF级动物实验室，实验动物使用许可证SYXK（鄂）2015-0027。

（1）建筑特点

门采用专用净化密闭门并配备观察窗。单向走道呈顺时针走向设计。屏障系统内共有大鼠饲养室1间，小鼠饲养室3间，隔离观察室1间，实验准备室1间，洁物存放室1间，清洗消毒室1间。此外，屏障系统外配有监控室、机房和配电室等。

（2）设计参数

室内温度：20～26°C；日温差：≤4°C；相对湿度：40%～70%；换气次数：15～20次/h；气流速度：≤0．2m/s；压强梯度：20～50Pa；空气洁净度：7级；菌落数：≤3个/皿；氨浓度：≤14mg/m3；噪声：≤60dB；Z低工作照度：≥200lx；动物照度：15～20lx；昼夜明暗交替时间：12/12h。

（3）通风和空调系统

动物实验室采用全新风中央空调通风系统。空气经过初、中、三级过滤器后进入实验室内环境。

（4）照明系统

一更、淋浴、二更、气闸、清洁走道、洁物存放处、污物走道、缓冲间和清洗消毒间、动物饲养室、实验准备间、隔离观察室和功能实验室等安装有手动和自动开关，根据实际需要，调节控制室内照明灯。未启用房间、清洁走道、洁物存放处、污物走道等在每日中午12点和晚上8点开启紫外线灯照射1h。

（5）通讯系统

因为SPF级动物实验室的环境和设施具有特殊要求，人员进入后不能随意出入，而室内外的联系又十分重要，故室内各房间均安装内部电话机，按照房间顺序编排电话号码，各室内电话可相互连通，并均与监控室总机保持联系，保证实验室内外信息的及时沟通。

（6）监控系统

对SPF级动物实验室的出入口、走道、实验动物饲养室、功能操作室等重要位置均安装了可作270°旋转的摄像机，能够及时了解设施的运行状态；也能有效督促实验人员执行科学的操作规程，避免人为因素造成室内环境和设施的污染；并对整个实验期间的动物状态和反应进行观察，减少对动物的滋扰。

（7）供水系统

SPF级实验动物饮用水以纯净水为宜。本实验室采用管道供水，将处理后的纯净水用塑胶管道输送到屏障系统内实验准备室，设置接水槽，为实验动物供应灭菌的饮用水和屏障系统内用水。要经常更换和清洗输水管道，清洗笼具的用水添加适当比例的84消毒液。

（8）供电系统、警报系统和消防设施

SPF级动物实验室要求全天候不间断供风和供电，如果出现故障，不能及时发现和处理，就可能导致环境设施的污染、动物感染或死亡，造成严重后果。因此应对SPF级动物实验室使用独立稳定的供电系统，并配备有应急电源。在中央空调机房控制室安装风机故障警报系统，以便及时检修和维护，保证设施的安全运行。

（9）消毒灭菌设备

为防止外界物品进入SPF级动物实验室时所携带的细菌污染室内环境和造成动物交叉感染，按照不同物品的特性，进行紫外线照射消毒、渡槽消毒液消毒或专用的机动门真空灭菌器消毒。

（10）动物饲养笼具

饲养大、小鼠的笼具聚碳酸脂材料的塑胶笼具，具有高透明、耐高压、耐高温、耐酸碱等特点。通用的不锈钢笼具长、宽、高分别为40、30、20cm，适用于单笼饲养有特殊要求的实验动物，配有底盘和食槽，确保实验动物有充足的采食和活动空间，同时也保证室内环境的清洁。

（11）垫料的选择和使用

在使用塑胶垫料时，垫料是大小鼠直接接触的铺垫物，起到吸湿、保暖和造窝的作用。垫料的好坏直接影响到大小鼠术后的恢复、生长发育和繁殖性能。目前，所使用的垫料主要有玉米秸垫料、刨花垫料。

（12）饲料配制

大小鼠的生产型饲料和维持型饲料必须严格按照国家标准，进行科学配制生产。每半年检测一次饲料的微生物指标和有效营养成分指标，保证饲料的质量。

1 Leptin敲除大鼠表现肥胖表型

从出生后1月龄始, Leptin敲除大鼠比野生大鼠表现出现显著的体重增加，1月龄Leptin-/-雌、雄鼠体重比同窝大鼠（Leptin+/+）分别增加了27%和37%，到3月龄时Leptin-/-雌、雄鼠体重比同窝大鼠（Leptin+/+）增加了38%和39%，6月龄、8月龄时Leptin-/-雌鼠体重是同窝大鼠（Leptin+/+）的2.3倍，6月龄、8月龄时Leptin-/-雄鼠的体重是同窝大鼠（Leptin+/+）的1.8倍和2.0倍(见图1C和图1D)。MRI结果也观察到Leptin-/-大鼠皮下和腹腔脂肪积累的增加（图1B）。麻醉处死4月龄大鼠，剥离皮下及腹腔脂肪并称重，证实Leptin-/-大鼠的皮下和腹腔脂肪的重量分别是Leptin+/+大鼠的20倍和4倍。

图2 Leptin敲除(Leptin-/-)大鼠表现肥胖。

A：6月龄Leptin+/+大鼠（左）和Leptin-/-大鼠（右）。 B，Leptin-/-大鼠MRI分析,白色部分为高反射的脂肪组织。C：1-8月龄的雌性Leptin+/+（n=5）及Leptin-/- 大鼠（n=5）的体重变化。D：1-8月龄的雄性Leptin+/+（n=4）及Leptin-/- 大鼠（n=2）的体重变化。*，p<0.05。

2 Leptin敲除大鼠肝脏中大量脂肪沉积

取材4、8月龄雌性Leptin-/-大鼠及Leptin+/+大鼠肝脏固定，石蜡包埋及切片，HE染色观察结果显示，4月龄 Leptin-/-大鼠与Leptin+/+大鼠相比，没有明显的病理变化，8月龄 Leptin-/-大鼠肝脏肝小叶中出现大量脂肪空泡，提示肝细胞脂肪变性。

图3 Leptin-/-大鼠肝脏组织脂肪变性（40×）。

4M ,4月龄雌性Leptin-/-大鼠（n=2）及Leptin+/+大鼠（n=2）； 8M ，8月龄雌性Leptin-/-大鼠（n=2）及Leptin+/+大鼠（n=2）。

3 雌性Leptin敲除大鼠空腹血糖升高

比较出生后1月龄至8月龄，Leptin+/+雌鼠和Leptin-/-雌鼠的空腹血糖值（见图2）。雌鼠自1月龄起，Leptin-/-大鼠的空腹血糖值就显著高于Leptin+/+大鼠（40%），3月龄比Leptin+/+大鼠高33%，6月龄血糖降低但仍然比Leptin+/+大鼠高26%，8月龄时比野生大鼠高出11%，高血糖表型可以维持5个月以上。雄性Leptin+/+大鼠和Leptin-/-大鼠的空腹血糖值没有显著差异。

图4 Leptin-/-基因敲除大鼠空腹血糖受损。

1,3,6,8月龄的雌性Leptin-/-大鼠（n=5）及Leptin+/+大鼠（n=5）的空腹血糖变化。*，p<0.05。

4 Leptin敲除大鼠出现明显的胰岛素抵抗

4月龄时，对Leptin-/-大鼠进行糖耐受实验(图4a)和胰岛素耐受实验(图4b)，测定结果显示4月龄的Leptin-/-大鼠就出现了明显的高胰岛素血症及胰岛素抵抗的症状。

图5，4月龄Leptin-/-大鼠的糖耐受曲线和葡萄糖刺激下的胰岛素曲线

Leptin-/-大鼠和Leptin+/+的腹腔糖耐受曲线(n=5)；b，葡萄糖刺激下的胰岛素曲线(n=5)；

5 Leptin敲除大鼠胰岛增生

取材4、8月龄雌性Leptin-/-大鼠及Leptin+/+大鼠的胰腺组织固定，石蜡包埋及切片，H&E染色观察基因敲除大鼠胰腺病理学变化（见图4）。结果显示，6月龄 Leptin-/-大鼠与Leptin+/+大鼠相比，胰岛体积增大，但是数量增多不明显，且胰腺也没有脂肪细胞浸润，而8月龄Leptin-/-大鼠胰岛数量明显增多，体积增大更显著，胰腺内较多脂肪细胞浸润，胰岛形态由于快速扩张而极不规则。胰岛素抗体免疫组化显示，4、8月龄Leptin-/-大鼠β细胞增多，胰岛素分泌大大增加（见图5）。

图6 Leptin-/- 大鼠胰腺组织胰岛病理学观察。

4M,4月龄雌性Leptin-/-大鼠（n=2）及Leptin+/+大鼠（n=2）； 8M ，8月龄雌性Leptin-/-大鼠（n=2）及Leptin+/+大鼠（n=2）。

瘦素基因(Leptin)敲除大鼠

背景品系为SD(Sprague Dawley, SD)大鼠，为大鼠（rat；rattus norregicus）的一个品系，属于动物界、脊索动物门、脊椎动物亚门、哺乳纲、啮齿目、鼠科、大家鼠属（Genus Rattus）、大家鼠种（Speciesrattus norvegicus）的动物，1925年，美国斯泼累格•多雷（Sprague Dawley）农场用Wistar大鼠培育而成。

利用TALENs和显微注射技术,获得一只在Leptin编码区418- 425位碱基缺失的大鼠，由于同时产生了TGA终止密码子(图1b)，导致该蛋白C末端缺失了28个氨基酸。

图1 western blot检测Leptin+/+大鼠和Leptin-/-大鼠肝脏中leptin的表达。

一、疾病名称

肥胖症(obesity)是一种由多种因素引起的慢性代谢性疾病,以体内脂肪细胞的体积和细胞数增加,从而导致体脂占体重的百分比异常增高并在某些局部过多沉积脂肪为特点,早在1948年,WHO已将肥胖症列入疾病分类名单,2000年,WHO将吸烟,肥胖和艾滋病列为人类的三大杀手。

二、疾病临床表现及致病机制

肥胖症可以引发生理,心理和社会问题,已证实肥胖症是心脑血管疾病, 胰岛素抵抗, 2型糖尿病,某些癌症的重要危险因素。

（1）肥胖症与心血管系统肥胖症患者并发冠心病、高血压的几率明显高于非肥胖者，其发生率一般5～10倍于非肥胖者，尤其腰臀比值高的中心型肥胖患者。

（2）肥胖症的糖、脂代谢进食过多的热量促进三酰甘油的合成和分解代谢，肥胖症的脂代谢表现得更加活跃，相对糖代谢受到抑制，这种代谢改变参与胰岛素抵抗的形成。肥胖症脂代谢活跃的同时多伴有代谢的紊乱，会出现高三酰甘油血症、高胆固醇血症和低高密度脂蛋白胆固醇血症等。糖代谢紊乱表现为糖耐量的异常甚至出现临床糖尿病

（3）肥胖症与胰岛素抵抗体脂堆积可引起胰岛素抵抗、高胰岛素血症。

（4）其他肥胖者嘌呤代谢异常，血浆尿酸增加，使痛风的发病率明显高于正常人，伴冠心病者有心绞痛发作史。肥胖者血清总胆固醇、三酰甘油、低密度脂蛋白胆固醇常升高，高密度脂蛋白胆固醇降低，易导致动脉粥样硬化。由于静脉循环障碍，易发生下肢静脉曲张、栓塞性静脉炎、静脉血栓形成。