关节炎小鼠模型

为了研究Npsn在斑马鱼中性粒细胞中的功能，我们运用CRISPER/Cas9技术对斑马鱼npsn进行全基因组敲除，并且获得了一系列npsn基因发生移码突变的突变体斑马鱼，比如在exon5-Cas9靶点获得的（-7，+0）（npsnsmu5）突变体，和在exon6-Cas9靶点处获得的（-0，+1）（npsnsmu6）突变体，并且经预测它们的蛋白结构相对于野生型斑马鱼出现移码突变和提前终止。但是我们通过WISH检测发现在npsnsmu5突变体斑马鱼中，npsn的信号几乎是缺失的，并且qRT-PCR结果也同样证明了在npsnsmu5突变体中npsn的mRNA水平下降到野生型斑马鱼的5%左右，可能是由npsn的无义突变导致了mRNA的全面降解所导致的。但是npsnsmu5纯合突变体胚胎能够正常存活到成年，大小和体型正常，并且是可以正常的产生后代。

为了研究Npsn缺陷是否影响斑马鱼中性粒细胞的发育，我们通过斑马鱼中性粒细胞特异性标记基因mpx和lyz的整体原位杂交，发现npsnsmu5突变体和野生型斑马对比，mpx+和lyz+信号点的数量没有明显差别。苏丹黑染色也同样发现SB+阳性细胞的数量也没有差异。并且进一步在DIC下观察npsnsmu5突变体和野生型斑马鱼中性粒细胞中的颗粒，也未发现明显区别。以上结果表明，Npsn缺陷并不显著影响斑马鱼中性粒细胞的发育和数量。这可能是因为Npsn只是斑马鱼中性粒细胞中的一种酶颗粒，缺失后并不影响中性粒细胞的发育，但是可能影响了中性粒细胞的某些功能。

为了研究Npsn缺陷对斑马鱼中性粒细胞功能的影响，而中性粒细胞的主要功能是参与机体的固有免疫反应，因此我们做了斑马鱼大肠杆菌的侵染实验。我们利用显微注射的方式感染npsnsmu5突变体和野生型斑马鱼胚胎的卵黄囊，通过记录并比较感染后两者的生存率，发现npsnsmu5突变体在感染大肠杆菌后生存率相对于野生型胚胎显著下降，体内残余的菌量明显上升，并且在感染的早期阶段，npsnsmu5突变体中炎性因子的表达水平比野生型明显升高，这说明了中性粒细胞在抵抗细菌感染中存在功能缺陷。为了进一步验证Npsn在中性粒细胞抵抗感染中的作用，我们通过构建斑马鱼Npsn过表达的转基因系Tg(hsp:Myc-npsn)，并且同时感染大肠杆菌，发现Npsn过表达后能显著提高感染后斑马鱼的存活率。这个结果进一步表明，斑马鱼Npsn有助于斑马鱼抵抗细菌感染。

但是Npsn通过哪种方式来帮助中性粒细胞抵抗感染的呢？先前有体外实验证明，鲤鱼的Npsn能够水解纤连蛋白和明胶，而这两种组分又是细胞外基质的重要成分，那么Npsn是否通过影响斑马鱼中性粒细胞的迁移来影响对大肠杆菌的抵抗的呢？为了验证这个观点，我们观察了在感染后4小时时伤口处中性粒细胞的数量，但是比较npsnsmu5突变体和野生型斑马鱼并没有发现明显差异。另外，Npsn作为一种水解酶，它能否能够直接水解和破坏大肠杆菌细胞的完整性，进而影响大肠杆菌在机体内存活的呢？并且Npsn缺陷主要影响斑马鱼清除哪种类型的菌呢？为了验证这些问题，我们也将npsnsmu5突变体斑马鱼和野生型斑马鱼同时感染了其他类型的菌，如革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌和革兰氏阴性菌铜绿假单胞菌等，发现Npsn缺陷后可能增加斑马鱼对革兰氏阴性菌的敏感性。但是Npsn影响斑马鱼中性粒细胞抵抗细菌感染的具体机制，还需要更多的实验来验证。另外npsnsmu5突变体可以作为斑马鱼免疫与炎症反应模型，对研究在感染过程中，中性粒细胞与病原菌的相互关系，以及对研发新的抗菌药物具有重要的指导意义。

动物模型的制备和应用实验必须在具备相应资质的实验室开展。动物模型的制备、应用过程中的监督管理、处置措施、对环境和生态影响等应符合国家相关法律规定。

1、模型的形态特征

患病小鼠四肢的脚趾、脚掌以及踝部关节会出现红肿，严重则关节僵直，行动受阻。如图1所示。

图1：模型组小鼠发病后与对照组小鼠的足部状态对比。（A）、（C）模型组小鼠脚趾、脚掌、踝部关节出现红肿。（B）、（D）对照组小鼠不发病，足部状态正常。

对小鼠的发病情况进行统计学分析，如图2所示。模型组小鼠在第3天发病，病情在第9~10天达到一个高峰状态；第10~11天可选择性地再次注射25~50μg LPS，延长发病周期，病情加重，在第14~15天以后病情逐渐缓解。若不进行二次注射，炎症症状则从第11天开始逐渐下调。

图2中（A）显示模型组小鼠在第8天发病率达到100%，对照组全部不发病，故在图中不予显示。（B）显示模型组小鼠四肢发病数平均在3~4肢，在第12天病情达到最高峰，对照组不发病。（C）为对关节炎发病程度的评价，测量小鼠的踝部关节以及脚掌肿胀厚度，根据病情严重程度为其打分：足部无红肿，不发病——0分；1~2个脚趾红肿，或有轻微的红肿或红斑——1分，3~5个脚趾红肿或足部有较明显的红肿——2分；整个足部严重红肿，关节僵直——3分；每只动物最高分数为12分。对照组不发病故全部分数为0。

图2：统计小鼠足部发病情况。（A）发病率（B）四肢发病的数量（C）病情评价打分

2、模型的病理特点

（1）组织切片染色进行病理学分析

实验进行至第18~19天，处死动物收集样本。取小鼠四肢（主要为足部部分）浸没于10%中性福尔马林中进行固定，随后经甲酸脱钙后，石蜡包埋，切片，苏木素伊红（HE）染色，显微镜下观察。

如图2显示，（A）、（C）为模型组小鼠样本，表现为软骨受侵蚀，关节囊纤维组织增生，炎细胞浸润，骨质受破坏，滑膜细胞脱落，腔内积液等。（B）、（D）为对照组，其软骨面完整平滑，无增生与积液现象，表现正常。

图3：小鼠足部样本HE染色。（A）模型组：软骨侵蚀，关节囊纤维组织增生，炎细胞浸润，骨质破坏。（C）模型组：软骨面破坏，滑膜细胞脱落，有积液。（B、D）对照组：正常。

（2）CT检测骨骼损伤情况

将经10%中性福尔马林固定后的小鼠足部样本进行CT扫描拍片，观察其足部的骨骼损伤情况。如图4所示，（A）、（C）图中为模型组小鼠骨骼，骨骼表面不平整，扭曲变形，新生骨与破骨并存，骨骼损伤严重。（B）、（D）为对照组，骨骼表面与腔内平滑，正常无损伤。

图4：小鼠足部样本CT。（A）模型组表面俯视图（B）对照组表面俯视图（C）模型组截面图（D）对照组截面图

（3）模型组织中细胞因子表达情况的分析

检测小鼠关节与血液中几种主要的促炎性细胞因子的表达情况，如图5所示。其中IL-6、IL-17、TNF-α都是在炎症反应中起重要作用的促炎性细胞因子。IL-6对破骨细胞介导的骨质吸收、滑膜炎等炎症进程起关键作用，也是机体炎症反应的标志性细胞因子。IL-17是一种主要由活化T细胞产生的促炎性细胞因子，在T细胞介导的滑膜炎、骨破坏等过程起关键调节作用，是关节炎发生发展中最标志性的调节因子之一。TNF-α能够促进粘附分子和蛋白酶表达，在骨破坏以及滑膜细胞增生等过程中起重要作用[3]。因此，这些促炎性细胞因子的表达水平反应了病情的严重程度。

取得小鼠关节样本，提取RNA，反转录得到cDNA，通过Real-Time PCR检测关节中促炎性因子的相对表达量；提取小鼠血清，通过流式细胞术进行分析，检测血清中促炎性因子的表达量。虽然在取样时间段（第18~19天）炎症反应正逐渐下调，关节与血清中的IL-6、IL-17、TNF-α的表达量仍然高于正常水平。

图5：（A）关节中炎症因子的相对表达量（B）血清中炎症因子的表达水平

1、实验动物

C57BL/6J小鼠，属动物界、脊索动物门、哺乳纲、啮齿目、鼠科、小家鼠种（Mus musculus），1921年Abby Lathrop得到动物后开始近亲交配，育成数个近交系。本实验中于SPF级动物房饲养。

2、模型构建

使用8~9周龄的C57BL/6J雌性小鼠，分为两组，每组各6~7只。

关节炎诱导试剂为Chondrex公司生产的Arthrogen-CIA®ArthritogenicMonoclonal Antibody试剂盒。

对于模型组小鼠，每只腹腔注射5mg胶原抗体混合物，记为第0天，第3天时腹腔注射25~50μg LPS，能够快速诱导发病；第10~11天可选择性地再次注射25~50μg LPS，使加重病情，延长发病周期，继续观察。对照组在同样的时间腹腔注射等体积的PBS。

一、疾病概况

类风湿性关节炎(Rheumatoid Arthritis，RA)是一种以滑膜持续炎症和关节软骨及骨破坏为特征的慢性进行性的自身免疫性疾病，以关节滑膜炎及对称性、破坏性的关节病变为主要特征。RA在我国的发病率为0. 26%~0. 5%，能够发生于任何年龄，女性发病多于男性[1]。RA炎症反应造成患者机体肉芽组织和纤维增生，使得关节腔内的血供严重受损；严重的缺血使得局部出现坏死，以累及周围关节为主，故其基本病理改变为滑膜炎[2]。主要临床表现为关节肿痛，继而软骨破坏、关节间隙变窄，晚期因严重骨质破坏、吸收导致关节僵直、畸形、功能障碍。

该疾病为一种反复发作性疾病，致残率较高，预后不良，目前还没有很好的根治方法。

二、发病机制

类风湿性关节炎的发病的主要因素有：（1）B细胞的介导作用与自身抗体的产生；（2）T细胞、巨噬细胞的介导作用与细胞因子网络；（3）遗传因素。但就目前来讲，RA的病因及发病机制尚不完全明确，其可能与具有某些遗传特征的人群对一些抗原刺激具有敏感性而引发的免疫应答反应所导致的病理性改变有关。免疫调节机制、功能障碍是导致RA的主要机制，在RA患者的滑膜组织中出现异常增多的T、B淋巴细胞和白细胞介素、趋化因子、干扰素等细胞因子以及自身抗体等均提示这些物质有可能参与RA的发生和发展[1]。