睡眠干扰所致大鼠学习记忆障碍模型

给予动物鼠笼倾斜、潮湿垫料、高温、噪音、束缚、电击、游泳、昼夜节律颠倒等不同刺激因子，且刺激因子安排为多变性和不可预测，可诱导性是模型制造成功的关键。该模型被广泛用于抑郁症神经生物学机制及抗抑郁药物的研究，以及伴发的焦虑、学习记忆障碍及防护药物研究。

本研究中，通过水迷宫实验、避暗实验结果可以看CUMS模型组水迷宫寻台潜伏期显著性延长，避暗错误次数显著性增加、避暗潜伏期显著性减少等，这些行为学结果，提示大小鼠CUMS模型成功。此外本实验还对CUMS模型的机制进行了基础研究，认为CUMS模型会导致动物皮层的5-HT、DA、Ach、NE等神经递质水平显著性降低（P<0.05）。因此我们认为采用慢性不可预测应激，35天可以造成大鼠和小鼠学习记忆障碍。

模型技术难点在于对于CUMS刺激因子的选择，刺激因子的选择可能影响实验模型的成功与否，常用的刺激因子有禁食(12 h)、禁水(12 h)、冷水游泳(4 °C，5 min)、热水游泳(42 °C，5 min)、动物叫声(0.5 h)、束缚(使用自行研发的小鼠行为限制器，长20 cm，直径7 cm)、昼夜颠倒、配对饲养、湿笼、倾笼等。每日选择2~3 种刺激，并尽量使应激程序符合不可预测的特点，以避免动物产生适应性。相同的刺激因子应该隔3-7日再进行。

本研究通过不同的刺激因子对老鼠造成慢性不可预测应激模型，通过水迷宫、避暗等经典行为学指标，以及5-HT、DA、Ach、NE等神经递质基础机制指标，表明了慢性不可预测应激诱导老鼠学习记忆损伤模型的成功，并且该模型对于大小鼠具有相同的效果，本模型可用于进一步的改善学习记忆药物的药效学评价。

本实验采用健康成年SPF级老鼠。饲料垫料均为高压灭菌产品，购自北京维通利华实验动物有限公司，动物用水均经过除菌处理。实验动物以完整的包装直接进入实验室，观察适应5天后无异常情况，方进行实验。实验过程中动物操作均符合动物伦理学规范，对环境和生态影响等符合国家相关法律规定。

1. 睡眠干扰对动物体重及自主活动的影响

通过对同一批动物慢性睡眠干抗不同时间体重的检测结果表明，慢性睡眠干扰７天时，模型组动物体重明显减轻，到慢性睡眠干扰14天，模型组动物体重有恢复趋势，说明模型组动物的状态从不适应造模到适应再到不适应的过程。自主活动实验结果也表明，慢性睡眠干扰14天对小鼠的总路程、运动时间和静止时间等指标均无显著性影响。

表1 不同强度睡眠干扰对小鼠自主活动的影响

2. 新物体识别实验结果

对照组相对辨别指数显著大于０，说明对照组动物对熟悉物体有记忆，能够辨别出熟悉物体和新物体；模型组１（滚筒旋转方向：固定）和模型组２（滚筒旋转方向：随机）相对辨别指数与０比较均无显著性差异，说明模型组动物不能辨别记忆熟悉物体和新物体。

图2 不同强度的睡眠干扰对小鼠新物体识别相对辨别指数的影响（模型组1：滚筒方向固定；模型组2：滚筒方向随机）

3. 水迷宫实验结果

模型组１（滚筒旋转方向：固定）定位航行潜伏期在Ｄ１和Ｄ４天显著増加；模型组２（滚筒旋转方向：随机）定位航行潜伏期在Ｄ１、Ｄ４和Ｄ５天均显著増加。

模型组１（滚筒旋转方向：固定）目标象限穿台次数有降低趋势，但无显著性差异，目标象限游程比率和目标象限时间比率均无明显变化；模型组２（滚筒旋转方向：随机）目标象限穿台次数有降低趋势，但无显著性差异，目标象限游程比率和目标象限时间比率均显著降低。表明长期的慢性睡眠干扰使动物的空间学习记忆能力下降。

图3 不同强度的睡眠干扰对小鼠水迷宫定位航行潜伏期的影响（模型组1：滚筒方向固定；模型组2：滚筒方向随机）

一般选用SPF级Wistar大鼠（8-10周龄）和ICR小鼠（（4-6周龄）。雄性多见。常规饲养。

1. 模型制作技术规程

使用大、小鼠睡眠干扰仪进行建模，自行设定控制参数，仪器运转，对睡眠干扰仪内饲养动物进行睡眠干扰。实验分为两个阶段：

1.1滚筒适应期

在睡眠干扰仪内水瓶装满动物饮用水、食物后，将除去空白对照组之外的动物放入睡眠干扰仪中，设置干扰参数如：转速（1r/min），转圈1圈，休息时间（2min），随机转动。设置完成后，选择“开始”，实验开始，仪器开始运转。每天3小时（每天固定相同时间段），连续滚筒适应3天。实验结束后打开滚筒壁取出动物，放回动物房。

图1 睡眠干扰仪装置图

1.2 造模期

滚筒适应结束后开始正式造摸，将除去空白对照组之外的小鼠按上述步骤放入睡眠干扰仪，按适应期设定的参数，进行连续睡眠干扰至少14天。空白对照组饲养于动物房内。

2. 模型分析指标

（1）空场实验 于检测当天将睡眠干扰仪内的动物取出提前放于检测房间进行适应，腹腔注射给药30 min后，将小鼠放入自主活动测试箱内。待小鼠适应测试箱环境3 min后开始检测，检测时间为10 min。计算机对摄像头实时监控到的小鼠视频图像进行分析处理后，得到小鼠的总路程、运动时间、静止时间等一系列指标，以此来分析小鼠的自主活动情况。

（2）新物体识别实验 实验过程分为 3 个阶段: 适应期、熟悉期、测试期。适应期为 3d， 每天将动物依次放入实验箱内，熟悉环境 10 min。适应期结束后，次日进行熟悉和测试。熟悉期时，将两个完全相同的物体放入实验箱内对称的位置处，此两物体距离侧箱壁、箱后壁的距离均为 10 cm。记录小鼠鼠 5 min 内对两物体的探索总时间。间隔 30 min 后，进入测试期。测试期内，将其中一个熟悉物体换为另一个大小相近但形状和颜色不同的新颖物体，记录小鼠对新颖物体和熟悉物体的探索时间，用辨别指数 ( discrimination index，DI) 来评价动物的学习记忆能力。辨别指数计算公式为 DI = ( N-F) /( N + F) ×100% ， 其中N( new) 为新颖物体探索时间，F( familiar) 为熟悉物体探索时间。

在实验过程中，为避免动物对某一位置产生偏爱，物体的位置要相互平衡，以便减少实验误差。新物体识别实验反映的是动物对物体辨别的短时、非空间记忆能力。

（3）水迷宫实验

3.1 水迷宫空间记忆

迷宫分为 4 个象限，将平台置于其中一个象限中央，作为实验中动物逃离水环境的唯一途径， 空间记忆阶段保持平台位置固定不变。选择其余 3 个象限作为动物的入水点将动物面向池壁放入水中，每天训练 3 次，每次变换入水点位置( 使动物可分别从 3 个象限入水)，且每天所有动物入水点的顺序保持一致。每次训练前适应 10 s，使动物获取并学习空间环境信息。设置检测时间为 60s 后，将动物放入水中，若动物在 60 s 内找到平台，算作寻台成功并记录其潜伏期，并使其在平台上停留休息 10 s。若动物在 60 s内未找到平台，结束此次训练并记录潜伏期为 60 s，并引导动物靠近平台使其在平台上停留 10 s。每只动物训练的时间间隔为 40 min。每天每只动物 3 次训练学习的潜伏期平均值，作为评价动物这一天学习能力的指标。经过 5d 的训练学习后，第 6 天撤去平台， 进行空间探索实验。将动物从原平台象限的对角象限面向池壁放入水中，检测其在 60s 内在原平台象限的游程比、时间比，以及穿过原平台所在位置的次数，作为评价空间记忆能力的指标。

睡眠干扰(Sleep Interruption，SI)是指由于环境或自身原因无法满足正常睡眠的情况，一般指在24小时中的睡眠小于4小时。睡眠干扰可以分为部分睡眠干扰（partial sleepinterruption, PSI）和完全睡眠干扰（total sleep interruption, TSI）。TSI指24h之内完全无睡眠；PSI一般指24h之内睡眠量通常达不到4h。从1896年Patrick等首次研究睡眠干扰对人体的影响以来，睡眠的重要性受到了科学界的广泛关注。包括航空航天航海等军事特因环境下，由于昼夜生物节律颠倒，睡眠周期紊乱，睡眠不足或睡眠障碍，造成作业人员机体免疫力、作业能力、警觉性和判断力降低，影响作业任务的完成，严重者危及生命。

睡眠干扰包括物理和化学两种因素诱导的睡眠干扰。化学药物(多为一些中枢兴奋药)注射可剥夺部分或全部睡眠，如咖啡因、去氧麻黄碱、神经毒素(DSP-4)、可乐定等，但由于睡眠干扰效果不佳，动物个体差异等不易掌握而应用较少。物理睡眠干扰方法包括小平台水环境、滚筒、水平转盘、跑台、人工轻触刺激等方法。由于小平台水环境法因频繁落水造成物溺水死亡率高、人工轻触刺激需要消耗实验人员的体力而较少应用。目前应用较多的滚筒、水平转盘和跑台等。本文以滚筒法进行介绍。