盐酸诱导急性肺损伤小鼠模型

1. 该模型鉴定和评价的技术方法和指标体系，符合溃疡性结肠炎的病理特点，尤其与溃疡性结肠炎反复发作、迁延不愈的临床特点高度相似。

（1） 疾病活动指数

（2） 结肠指数

（3） 结肠组织大体评分

（4） HE 染色病理观察

（5） MPO 酶活性检测

2. 与国内外现有模型的异同

现有的溃疡性结肠炎的造模方法有单一化学法刺激、免疫法、免疫复合法、基因修饰法。虽然现在建造UC动物模型的方法多种多样，但是依旧存在着或多或少的缺陷。理想模型要简单易操作，同时尽可能全面、准确的模拟人类UC的病理生理学特点和表现，既要与自发的炎症诱因相近，又要符合肠道炎症进展、组织损伤进展等，同时模型病变尽量维持较长时间，能尽量反映慢性病变的过程和特点，以满足实验的需求。而目前尚缺乏能满足这些要求的模型，且已有模型以急性损伤模型为主。故亟待寻找更好的，具有良好重复性、稳定性，并且操作简单的动物模型，从而为研究UC发病机制、研发治疗新药物提供良好的基础。

3. 本研究的主要创新点或技术关键

3.1 创新点

本模型采用诱导剂联用的方法，建立慢性、炎症维持时间长且病程稳定的小鼠慢性 UC 造模方法。该模型改进了传统溃疡性结肠炎模型的病程短、稳定性差、模型指标缺少特异性等问题，更大程度的模拟了临床慢性溃疡性结肠炎病理指标。

3.2 关键技术

采用噁唑酮和2,4,6-三硝基苯磺酸两种诱导剂联用、致敏与感染相结合的方法，建立了新慢性、炎症维持时间长且病程稳定的小鼠慢性 UC 模型方法。

4. 可行性分析

4.1 前期摸索研究充分，通过阅读大量中外文献，较充分的了解溃疡性结肠炎疾病以及模型建立过程中的问题。

4.2 实验单位具备动物饲养许可证以及较先进的实验器材和检测设备。

4.3 通过阅读大量中外文献和走访调研，噁唑酮和三硝基苯磺酸在临床上应用广泛，效果明显，具有可行性。

本实验采用昆明种6-8周龄的健康成年小鼠，体重均在33±2g，SPF级。饲料垫料均为高压灭菌产品，购自北京斯贝福生物科技股份有限公司，动物用水为实验室制UP水经过除菌处理。饲养及实验操作均于具有检验合格资质的SPF级屏障动物室内进行，并且实验动物以完整的包装直接进入屏障实验室，观察室适应7天后无异常情况，方可进行实验。所有实验中小鼠均引颈处死，尽量减少动物手术创伤程度及失血量。实验过程中动物操作均符合动物伦理学规范，对环境和生态影响等符合国家相关法律规定。

1. 左肺弥漫性出血、渗出，而右肺损害不明显。

Fig1 肺部大体解剖

2. 肺泡灌洗液白细胞计数和蛋白浓度、肺湿干重比结果见表3~5。I ) 盐酸组与生理盐水组比较，肺泡灌洗液中白细胞计数呈显著增加；除30 min时间点， HCl组与相对应的各个时间点NS组的比较，其差异有统计学意义(P＜0.05)，并在6 hHCl组达到峰值(P值＜0.01)。II ) 肺泡灌洗液蛋白浓度6 h NS组时BALF蛋白浓度出现轻度升高(P值＜0.05 vs 12 h组)；HCl刺激6 h时达峰值并明显高于6 h NS组及其它时间点HCl 组。III )左肺肺湿干重比值(W/D)在HCl刺激30 min时明显升高，12 h达峰值后呈下降趋势，至24小时进一步恢复。

3. TNF-α、IL-6、IL-1β和NF-κB免疫印迹检测

NS组各时间点组肺组织TNF-α、IL-6、IL-1β和NF-κB的蛋白表达量无显著差异， HCl组6、12和24 h显著升高( P值＜0.01 vs NS组)，在12 h HCl组达到峰值( P＜0.05 vs 6 h 、24 h HCl组，Fig2)；肺组织IL-6蛋白表达量比较HCl组30 min开始显著升高( P＜0.01 vs NS组)， 6 h HCl组达到峰值( P＜0.01 vs NS组，P＜0.05 vs 30 min、24 h HCl组，Fig3)；肺组织IL-1β 蛋白表达量比较，HCl组30 min开始显著升高( P＜0.05 vs NS组)，在6 h HCl组达到峰值( P＜0.05 vs NS组， P＜0.05 vs 2 h、24 h HCl组，Fig4)；肺组织NF-κB蛋白表达量比较，HCl组30 min开始升高，在2 h、6 h和12 h HCl组表达量显著升高( P＜0.05 vs NS组，Fig5)。

4.病理学结果及肺损伤评分

NS组各时间点肺组织观察可见肺泡结构完整、清晰，无损害( Fig6 )；30 min HCl 组的肺组织未见明显损害或轻微损害，肺泡结构较完整, 肺泡间隔无明显水肿，有少量炎性细胞浸润( Fig6B)；2 h HCl组，弥漫性肺泡壁增厚、红细胞渗出和炎性细胞浸润( Fig6D黑色箭头所示)；6 hHCl组，肺组织损害显著，肺组织弥漫性的出血、水肿，肺泡壁增厚、结构紊乱，部分肺泡萎陷不张( Fig6F黑色箭头所示)；12 hHCl组较6 h HCl组损害程度减轻，肺间质轻中度水肿，肺泡结构破坏程度以及炎性细胞浸润较6 h组减轻(Fig6H黑色箭头所示)；24 hHCl组，肺组织水肿充血程度仍然较重，与6、12 h组相比肺部炎症程度较轻( Fig6J黑色箭头所示)。HCl 组与NS组各个时间刺激点相比较， (除外30 min) 的肺组织病理损伤评分显著升高，且差异有统计学意义(P＜0.001)；并且HCl组，6 h HCl 组肺损伤评分与2 h、12 h HCl组比较显著升高，且差异有统计学意义(P值＜0.05)。

Fig6 小鼠肺病理学改变 (H&E染色 ×400)

Fig7 肺损伤评分 与NS组比较显著升高 *P值＜0.001；6h组与2 h、12 h HCl组比较显著升高 #P值＜0.05；

5. 肺组织免疫组化结果

CD3为T淋巴细胞膜表面标记物，12 h HCl 组可见肺间质出现T淋巴细胞(CD3+)(Fig8H)，24 h时仍大量存在(Fig8J)；以CD68为细胞膜表面标记物的巨噬细胞，在6 h HCl 组的肺间质出现( Fig9F)，至24 h时仍然大量存在(Fig9J)；Gr-1主要为粒细胞膜表面标记物，30 min HCl 组开始在肺泡间质出现，部分与肺泡壁黏附，至24 h时仍然大量存在(Fig10)。

Fig8 肺组织CD3免疫组化-T淋巴细胞 (×400)

Fig9 肺组织CD68免疫组化-巨噬细胞 (×400)

Fig10 肺组织Gr-1免疫组化-嗜中性粒细胞 (×400)

呼吸功能(Pehn)： HCl刺激小鼠6-12 h时出现Pehn明显升高，提示起到阻力显著增加

Tab 6 各组呼吸功能 Pehn(x±s)

*P值＜0.01 vs相应时间点NS组; #P值＜0.05 vs 2 h组; ▲P值＜0.05 vs 24 h组

1. C57bL/6J小鼠 ，名称：C57bL/6J，近交系（Inbred Rat）

品系来源 ：1921年 C.C.Little用 Lathrop小鼠作近亲培育时，用No7雄鼠和No.52雌鼠交配，培育成C57。在C57中将毛色呈黑色的进行固定，培育成C57BL。1937年Ltle将维持的C57BL第六组亚系定名为C57BL6，将第十组亚系定名为C57BL10，继而分别维持至今。1947年从 Little引入到美国 Jackson Lab，形成C57BL/6J:1951年从 Jackson Lab将第32代引入到NH，形成c57BL6N亚系；1974年 Charles River从NH引入并于1975年进行了剖腹产。六十年代从 Jackson Lab引入到日本实验动物中央研究所,1986年自日本实验动物中央研究所引入到中科院上海实验动物中心。2001年中国北京维通利华从美国 Charles River引入第59代核心群。

2. 盐敏感大对照鼠SS-13BN Rat，名称：SS-Chr13BN/McwiCrlVr，同类系（Consomic Rat）

3.诱导方法：自制气管滴注导管，动脉导管( 内径0.28mm,427401, BD Intramedic PE Tubing)，长度4cm，插入端加热制成一定弧度，动物麻醉后颈前暴露气管，充分暴露喉部以及声门，配合冷光源的使用，可见光源由声门处透射出并随声门开合呈现闪烁感( Fig2A)；于声门张开瞬间，右手持导管向前上方平稳插入气管，有轻微突破感，拔出导丝，调整导管向左侧弯曲，缓慢向气管深处插入，深至距小鼠上门牙约2.8cm以确保导管末端置于左主支气管内，末端连接胰岛素注射器，向导管内缓慢推注0.1M浓度盐酸或生理盐水对照），推注过程大于10s，再补推注入约30倍液体体积的空气。竖直放置小鼠5min，术后小鼠给予保温措施等待苏醒，密切观察至72h，存活动物为成功造模动物。

急性肺损伤(acute lung injury，ALI）是由非心源性的各种严重肺内外致病因素如严重感染休克、创伤、DIC、误吸等原发疾病引起，临床主要表现为急性进行性加重的呼吸困难和难治性低氧血症,进一步发展可演变为急性呼吸窘迫综合征(ARDS）[1]。虽然ALI的病因多样，但研究显示它们是严重损伤引起机体全身免疫炎症反应失控过程中的不同阶段。而肺脏则是这一过程中最易受损的首位靶器官，所以ARDS出现最早发病率也最高。

正常的肺组织由肺泡上皮细胞和微血管内皮两大系统构成良好的肺泡毛细血管的屏障。无论哪种原因的损伤通过气道(直接肺损伤还是毛细血管(间接肺损伤))，而最终的结果是导致弥漫性的肺泡损伤[2]。当直接肺损伤因素作用于肺时，损伤首先累及肺泡上皮并促使肺泡巨噬细胞和炎症反应链的激活，导致肺内炎症反应，进而导致肺泡上皮的损伤。因此肺内源性ARDS病理表现为以肺泡腔内改变为主引起肺泡腔内水肿纤维蛋白、胶原蛋白渗出和中性粒细胞聚集，可合并肺泡内出血导致肺实变。而当间接肺损伤因素激活全身炎症反应肺外炎性介质通过循环系统进入肺内，肺作为全身炎症反应的靶器官引起进一步损伤的首先导致肺血管充血血管内皮细胞损伤血管通透性的增加及单核细胞淋巴细胞、多核细胞、血小板等炎性细胞的聚集，进而引起肺小血管的充血和肺间质水肿导致肺泡萎陷，但肺泡腔的结构一般正常。[3]利用小鼠HCl单侧吸入性急性肺损伤模拟人类临床急性肺损伤病变。