丙型肝炎病毒亚复制子斑马鱼模型

（一）模型评价方法：

1. 临床症状观察：

血清中肝功生化指标的两种转氨酶（ALT，AST）是肝损伤的重要标志物，GGT的变化除了能表明肝炎急性期和慢性期的情况，同时对于肝脏肿瘤也具有一定的指示作用。这些指标可通过常规血清检测得到数据。

2. 病毒载量测定方法：

（1）WHV病毒DNA的提取：

血清样本处理：用促凝采血管收集的血样，室温放置30min后，3000rpm室温离心10min，得到上层血清放入离心管中备用；组织样本处理：检测WHV病毒载量主要组织样本为肝脏，分别在每个肝叶取约50mg样本，用生理盐水漂洗后，加入到含蛋白酶K的DNA裂解液中，裂解16h至组织破碎完全。使用DNA提取试剂盒提取病毒DNA，最后用30μl水溶解DNA。短期保存可存放于4℃冰箱，若需长期保存需存放于-20℃冰箱。

（2）WHV病毒载量的测定：实时荧光定量PCR方法

实验前准备：DNA样品制备：待测样本：待检测的感染WHV病毒的土拨鼠血清，按照5.2.1所用方法提取WHV病毒DNA；标准品：已知浓度的WHV-DNA质粒，按照109、108、107、106、105、104、103copies/μl进行稀释；空白对照：分子级无菌蒸馏水 (无RNA酶和DNA酶)；阴性对照：未感染WHV病毒的土拨鼠血清；

实验步骤：（a）每个待检测样本反应液的组成为：

2×SYBRAdvantage qPCR Premix 10 ul primer-forward（20μM）1 ul primer-reverse（40μM）1 ul TemplateDNA 2 ul Total 20 ul

WHVprimer: Forward primer 5'-TCTCCTGGACTGGAAAGGTT-3'

Reverseprimer5'-ATTGAGCCAAGAGAAACGGG-3'

（b）扩增条件设定：

（3）仪器检测通道选择：

使用ABIStepOne Plus荧光PCR检测仪时选择SYBR Green荧光信号，收集设在58℃。具体设置方法请参照各仪器使用说明书。

（4）结果分析阈值设定：

使用ABIStepOne Plus荧光PCR检测仪进行结果分析，基线和阈值设定根据仪器噪音情况调整。

（5） 荧光定量PCR反应系统的质量控制：

a. 反应结果应同时符合以下条件，否则实验结果无效。

阴性对照：无扩增，为阴性。

标准品：CT值＜28

否则结果无效。

b. 结果判断：

阴性：无CT值或CT值大于38

阳性：CT值＜38，可报告为阳性。

CT值大于38的样本建议重做，若重做结果CT值＜38，该样本判断为阳性，否则为阴性。

阳性样本具体载量根据标准曲线进行计算。

图5. 荧光定量PCR实验的扩增曲线和标准曲线

3. 病理分析：HE染色

组织样本经固定、包埋、切片处理后，可通过H&E染色观察感染动物组织内的损伤情况和炎性细胞的浸润状况。具体步骤如下：

用10%福尔马林固定72h，在24h内可换液一次；将固定的组织修块后脱水、透蜡用石蜡包埋；随后石蜡块进行切片；石蜡切片脱蜡后，进行苏木精染色；切片继续脱水后染伊红；最后进行透明、封片，得到HE病理切片，可进行镜检。标本切片可长期保存。

（二）评价指标：

1. 临床症状评价：

由于免疫系统未发育完全，新生土拨鼠感染WHV病毒后，有60%-70%的概率发展成慢性感染。在感染急性期，肝功生化指标（ALT和AST）都有升高，表现出肝脏损伤；而长期的病毒复制导致慢性肝炎，期间虽然血液中检测的病毒载量会有波动，但肝部损伤加剧，且肝脏炎症和肿瘤标志物指标升高。

2. 病毒复制情况评价体系：

在急性感染期，WHV病毒在血液中的水平在感染后5-6个月达到峰值，平均载量约为107copies/ml。此后由于机体无法清除病毒，WHV在肝脏中长期复制，在血液中能持续检测到病毒核酸，病毒在血液中的水平大部分时间维持在104copies/ml。

3. 病理评价体系：

WHV病毒感染土拨鼠，在慢性期肝脏病理发生显著变化，可观察到慢性炎症表型，包括：肝窦扩张，大量炎细胞弥漫浸润等。

WHV病毒具有种属特异性，只感染土拨鼠，不感染人和其他实验动物；且未出现在《人间传染的病原微生物名录》中。动物感染病毒和饲养都可在普通环境中进行，但需跟土拨鼠繁殖区分开。WHV病毒已经过风险评估，具有相应标准操作程序。模型实验已得到IACUC批准，获得实验资质。

WHV病毒只对土拨鼠敏感，并不感染人、以及小鼠大鼠等常用的实验动物；在土拨鼠种群中常为垂直感染模式，实验室中采用的为血液感染模式。为预防对其他土拨鼠的影响，实验人员均需经过生物安全培训获得证书，具有生物安全操作资质；进入动物房之前，穿戴防护服、口罩、帽子、鞋套等进行防护；实验结束后按要求去除防护设备集中处理。尽量避免进入感染动物区后再进入繁殖区，若需进入则应更换整套个人防护设备。

由于感染WHV土拨鼠血液中可能存在着大量病毒，因此对于采血后的耗材、以及沾染到血液的垫料等，都需要进行高压灭菌处理，以消除正常土拨鼠的潜在感染源。动物感染病毒后取得的血液和组织直接放入核酸裂解液或组织固定液，灭活病毒。所有涉及到的相关污染物如离心管、灌胃针、手术剪、手术镊和毒株等将统一高温高压消毒后集中处理。

动物实验操作均在ABSL-2动物房的生物安全柜中进行，实验后将病毒毒株、动物尸体、尿垫等包装好进行高压灭菌处理，注射器放入利器桶处理。

1. 动物症状

所建 HCV 亚复制子模型为 HCV 基因暂态表达模型，未检测到对斑马鱼发育和生长的影响。

2. 模型鉴定

斑马鱼整体的荧光显微镜检测报告基因表达和原位杂交实验均检测到 HCV RNA多聚酶（NS5B）/基因和 HCV core 蛋白/基因在肝脏的特异性表达（图 1A-D）。以 WT型斑马鱼、单独表达 NS5B 和单独表达 HCV-core 反义模板的三组斑马鱼为对照，采用 RT-PCR 和 Western blot 检测，结果显示 NS5B 和 CORE 的基因和蛋白的共表达只出现在 HCV 亚复制子斑马鱼体内（图 1E，1F），证明所建模型的可信性和有效性。

图 1. 斑马鱼肝脏特异性的 HCV 亚复制子模型A. HCV 亚复制子基因构件示意图；B. 荧光显微镜检测 HCV-NS5B 基因在斑马鱼幼体(4 dpf)肝区特异性表达，红色荧光代表 NS5B 蛋白(556 nm excitation, 586 nm emission); C.一条 HCV 亚复制子幼体分别在白光、蓝色激发光和绿色激发光下的图像，显示 HCV 亚复制子基因组在肝区的复制，以绿色荧光代表 HCV-CORE 蛋白的 (480 nm excitation, 505 nm emission)；红色荧光代表NS5B 蛋白。D. 幼体原位杂交(WISH)结果，显示 HCV mini-RNA 基因组在肝区表达。标尺：150μm。 E.RT-PCR 检测 HCV core 和 ns5b 基因的表达；在此只有 HCV mini-genome 被复制后才能检测到 core 基因。F. Western blotting 验证 HCV CORE 和 NS5B 蛋白同时在 HCV 亚复制子幼体内表达，而不可同时出现在其它对照组。3. 病理改变HCV病毒在宿主细胞内的复制可以导致宿主相关基因表达水平的变化，如HCV效应基因：ScarF2、Leugpcr、Rasgbd和Argsyn。我们的检测结果表明，这些基因在HCV亚复制子幼体内的表达水平均高于野生型斑马鱼(图2A)，证明所建HCV亚复制子模型具有全病毒的一些病理特征。进一步检测内质网应激和UPR相关基因，如chop、atf4、atf6和bip基因也均高于野生型斑马鱼(图2B)。这些基因均与病毒性肝细胞炎性病变相关。

图 2. RT-PCR 检测 HCV 感染相关的宿主基因表达变化(8 dpf)A. HCV 效应基因 ScarF2、Leugpcr、Rasgbd 和 Argsyn 的转录水平；B. UPR 标志基因 chop、atf4、atf6 和 bip 的转录水平。*p < 0.05; **p < 0.001。

1. HCV 亚复制子基因载体

HCV 亚复制子基因载体由两部分组成：mini-HCV genome 和 HCV-RNA 多聚酶(NS5B)表达载体。具体构建：克隆小鼠肝脏特异的肝核因子 4a(mHNF4a)序列，并将此序列替换我们前期的 HCV 构件的 CMV 启动子，获得含有 GFP 报告基因的肝脏特异的 mini-HCV genome。克隆斑马鱼的肝型脂肪酸结合蛋白基因的增强子(L-fabpe)和人肝脂酶启动子序列(hLP)，并与 NS5B 编码序列和报告基因 RFP 序列重组到真核细胞表达载体上，获得肝脏特异的 NS5B 表达载体。这两个基因构件结构图见图 1A。

2. 实验动物

野生型斑马鱼 AB 品系。

3. 造模

取野生型斑马鱼受精卵（1-4 cell 期），通过显微注射将 HCV 亚复制子的两个基2因构件混合物(1–5 ng/ml)共注射到受精卵内。正常饲养。待胚胎发育至 4 dpf 幼体，进行后续检测。4. 模型分析指标

（1） 症状观察 以 WT 斑马鱼为对照，观察斑马鱼幼体表型和生长的变化。

（2） 病毒检测初筛：荧光显微镜下观察、拍摄幼体内报告基因的表达分布：在肝脏有绿色荧光蛋白和红色荧光蛋白共表达的幼体，即为 HCV 亚复制子模型个体。确证：采用斑马鱼整体原位杂交实验、RT-PCR 和 Western blot 检测 HCV 亚复制子的复制和 HCV 特异的复制酶 NS5B 的表达及其肝定位。

Table 1. PCR primers in this study

（3） 病理诊断HCV 基因可导致宿主体内病理变化，首先反映在相关基因表达的变化。我们采用 RT-PCR 和 Western blot 方法检测了 HCV 的效应基因如：Solute carrier family 2(ScarF2)、Leucine-rich repeat-containing G protein coupled receptor 5 (Leugpcr)、Ras-related GTP binding D (Rasgbd)和 Argininosuccinate synthetase 1 (Argsyn)；内质网应激和 UPR 相关基因如：chop、atf4、atf6 和 bip 基因。

一、疾病名称

丙型肝炎 (Viral hepatitis type C，HC)

二、临床发病机制及症状

病毒性肝炎(Viral hepatitis)是由肝炎病毒感染引起的以肝实质细胞变性、坏死为主要病变的常见传染病。常见的肝炎病毒有甲、乙、丙、丁、戊、庚六型。丙型肝炎病毒(HCV)感染者有 70％可转变为慢性肝炎，是罹患肝细胞癌的主要人群。HCV是一种(+)链 RNA 病毒，特异性侵袭人的肝脏；HCV 在肝脏细胞内的反复大量复制、导致宿主细胞病变、不断侵染周围正常肝细胞，是导致肝炎迁延不愈、促使肝纤维化、肝硬化，直至肝癌的重要诱因。为此，建立一种可模拟 HCV 复制过程又可在普通实验室操作的体内模型，可为研究 HCV 复制机制与宿主免疫和防御机制的相互作用提供实验研究平台，具有重要的理论意义和实用价值。

三、模式动物

斑马鱼(Zebrafish, Danio rerio) AB。