柯萨奇病毒A10型腹腔感染小鼠模型

本课题组采用7日龄ICR乳鼠、经腹腔注射CA10病毒的感染途径，成功获得CA10病毒感染小鼠模型。模型建立过程中采用临床评分标准对感染后动物的临床症状进行评价，并记录死亡率和体重情况；同时采用荧光定量PCR-标准曲线法对感染后动物血液和组织中的病毒载量进行测定，以确定病毒的复制情况。

本CA10病毒感染小鼠模型与文献报道的泰山医学院的史卫峰教授课题组的ICR乳鼠感染模型，都采用国际通用的封闭群ICR小鼠的乳鼠作为感染对象，都得到了具有典型神经系统病症的小鼠感染重症模型。在感染4天后动物出现明显的临床症状，包括驼背或炸毛，后肢无力，单后肢瘫痪，双后肢瘫痪，严重的直至死亡；之后几日临床评分不断升高，最终感染小鼠全部死亡。采集感染小鼠的血液和后肢肌肉组织样本，检测到病毒载量从第1天的低于检测水平（<200 copies/ul）上升到第3天的高水平（>106 copies/μl），说明病毒在机体内的大量复制扩增；尤其是在肌肉组织中病毒载量的结果与临床症状相吻合。两者的不同之处在于：使用的病毒株不同，来自于不同病人的临床分离株；小鼠的日龄不同，我们使用7日龄的ICR乳鼠，相对于5日龄小鼠更易于操作；感染途径不同，我们采用腹腔注射感染的方式，而非采用肌肉注射感染方式，更有利于观察和研究CA10病毒的嗜肌性。

CA10病毒感染模型的建立需要确定乳鼠的日龄和感染的剂量。由于CA10病毒对5岁以下儿童易感，相应的CA10病毒也只能使乳鼠在感染后表现出症状。我们试验了7日龄和10日龄的乳鼠，发现10日龄乳鼠感染后症状表现不稳定，因此选取了7日龄乳鼠作为感染动物。对于病毒感染剂量，我们也尝试了103、104、105 TCID50，选择了症状更为合适和稳定的104 TCID50。由于近几年CA10病毒成为我国手足口病的主要病原之一，引起广泛关注；而CA10病毒感染小鼠模型不仅可用于研究病毒的感染机制和机体的免疫反应，更是开发相应的特异性药物和疫苗的重要基础。

CA10病毒在人间传染病名录中属于第三类，涉及的实验需在BSL-2实验室进行，动物实验在ABSL-2实验室开展。CA10病毒已经过风险评估，具有相应标准操作程序。

CA10病毒对5岁以下儿童易感，主要通过粪口传播，对于具有BSL-2防护装备的实验人员危害较小；实验人员均经过生物安全培训获得证书；进入动物房之前，穿戴防护服、口罩、帽子、鞋套，防护眼镜等进行防护；实验结束后按要求去除防护设备集中处理。

成年ICR小鼠对CA10病毒不敏感，21日龄ICR小鼠在感染大剂量病毒后仍能自愈。对于感染动物的排泄物进行检测，在少数粪便样本中检测到少量病毒，载量约为2X102-103copies/mg；因此需对垫料等接触动物粪便的物品按要求进行高压灭菌处理。

动物感染病毒后取得的血液和组织直接放入核酸裂解液或组织固定液，灭活病毒。所有涉及到的相关污染物如离心管、注射器、手术剪、手术镊和毒株等将统一高温高压消毒后集中处理。

动物实验操作均在ABSL-2动物房的生物安全柜中进行，实验后将病毒毒株、动物尸体、尿垫等包装好进行高压灭菌处理，注射器放入利器桶处理。

1. 动物症状观察：

7日龄ICR小鼠感染CA10病毒4天后，出现不同程度的临床症状，症状由轻到重包括：驼背或炸毛，后肢无力，单后肢瘫痪，双后肢瘫痪，严重的直至死亡。感染后第5天，感染小鼠临床症状评分超过4分（图1A）；感染后第7天，感染小鼠全部死亡（图1B）。相对于正常组小鼠，感染小鼠体重增加减缓，从感染第1天的5.57g增加到第6天的7.33g，而正常小鼠从5.64g增加到8.03g（图1C）。

图1. ICR7日龄乳鼠感染CA10病毒后症状观察。A，感染后乳鼠的临床症状评分时间变化曲线；B，感染后乳鼠的存活率时间变化曲线；C，感染后乳鼠体重随时间变化曲线。

2. 血液和组织中病毒复制情况：

感染后第1天血液和肌肉组织中病毒载量都低于检测阈值。到第3天血液中病毒载量到达高水平1.7X107 copies/μl，随后血液中病毒载量下降至1.1X105copies/μl。后肢肌肉的病毒载量在感染后第3天和第5天都维持很高的水平，分别为2.9X107 copies/mg和6.1X107 copies/mg。

图2. ICR7日龄乳鼠感染CA10病毒后血液和组织中病毒载量情况。A，感染后第3天和第5天血液中病毒载量情况； B，感染后第3天和第5天后肢肌肉组织中病毒载量情况。

动物模型评价方法

1. 临床症状观察：

动物感染CA10病毒后观察10天，每天记录体重变化、症状和死亡率。根据症状严重程度，参照以下标准低动物进行临床评分打分：

0：未见异常；

1：驼背或炸毛；

2：后肢迟缓无力；

3：单后肢瘫痪；

4：双后肢瘫痪；

5：死亡。

2. CA10病毒载量测定方法：实时荧光定量PCR技术-标准曲线法。

2.1取样：分别在感染后第1天、第3天、第5天处死动物，采集血液100ul和后肢肌肉组织样本50mg，放入Trizol中；

2.2 RNA提取：采用Trizol法提取血液和肌肉组织中的RNA；

2.3 一步法荧光定量PCR检测病毒核酸浓度：

（1）特异性引物和Taqman探针：

Forwardprimer：GAAATGGRGTGTTGGAAACCA，

Reverseprimer：TTTCTGCGRAGTTGGACAAAG，

Probe:FAM-ATCAACCAYTTCTTCTCYCGCTCTGG-TAM；

（2）标准品：合成的CA10病毒核酸片段，浓度梯度为：2X109copies/μl、2X108copies/μl、2X107copies/μl、2X106copies/μl、2X105copies/μl、2X104copies/μl、2X103copies/μl、2X102copies/μl。共8个稀释梯度，每个浓度做3个重复。

（3）阴性对照和阳性对照：阴性对照用水代替核酸样本；阳性对照采用CA10病毒储液提取得到的核酸；

（4）荧光定量PCR试剂盒：Qiagen RNeasy Mini Kit（货号:74106），根据试剂盒要求准备反应体系；

（5）反应条件：①反转过程：50℃ 30min；②PCR过程：95℃ 15min；94℃ 15s，60℃ 60s，该步骤循环数为40；

（6）实验仪器：ABI Q3荧光定量PCR仪

（7）结果分析：

① 反应结果应同时符合以下条件，否则实验结果无效。阴性对照：无扩增，为阴性。

② 标准曲线：标准曲线R2大于0.95可用，若低于0.95数据不可用，则需重新测定；

③ 结果判断：根据标准曲线计算出CA10病毒的载量。病毒载量的检测阈值为2X10^{2 copies/μl，低于该数值的结果不可信。}

评价指标体系：

1. 临床症状评价：CA10病毒感染成功模型应具有典型的神经系统症状，即可观察到动物的重症肌无力表型，包括单后肢或双后肢瘫痪，根据临床评分标准感染CA10病毒5天后临床症状可达到4-5分，死亡率在感染7天后可达到80%以上。

2. 血液和组织中病毒复制情况评价体系：动物在感染CA10病毒后第1天、第3天、第5天采集血液和后肢肌肉组织样本，测定其中的病毒载量。经腹腔注射感染后，第1天病毒载量都低于检测阈值。CA10病毒首先在血液中复制达到较高水平，第3天的检测值在106 copies/μl以上，而到第5天血液中病毒载量出现下降，检测值在104 copies/μl-105 copies/μl；而在后肢肌肉组织中，CA10病毒载量由第3天的2.9X107 copies/mg上升到6.1X107 copies/mg，说明病毒在肌肉中发生了大量扩增，具有典型的嗜肌性，与临床症状表现相吻合。

1. 病毒准备：CA10病毒(GenBank: MF688814.1)，由医院咽拭子分离得到，在人横纹肌瘤细胞（RD）中培养、扩增，并采用反复冻融法释放病毒，离心富集病毒。具体操作如下：

RD细胞经常规传代培养接种到T75细胞培养瓶，感染前弃去原培养基，细胞用含2%双抗的PBS 洗2遍，吸出PBS后加入无血清DMEM培养基。接种适量的CA10病毒后，置37℃ 5% CO2培养箱孵育1-2h；加入完全培养基继续培养。接种病毒后2-3d病变CPE达到+++～++++，将T75细胞瓶置封口袋中，-80℃超低温冰箱冻化3次。然后将培养液转移至50mL离心管中，4℃，2000rpm离心20min，沉淀细胞碎片。吸取病毒上清，分装后冻存，并测定病毒滴度TICD50。

2. 实验动物：采用SPF级7日龄ICR小鼠乳鼠，母鼠自然哺乳，在ABSL-2实验室独立饲养。CA10动物模型建立实验通过IACUC审核，符合动物实验要求。

3. 病毒感染：根据预实验确定的感染剂量，即104TCID50CA10病毒，将病毒经腹腔注射感染小鼠，注射剂量为100μl。对照组注射同等量的RD细胞上清。

一、疾病概述

手足口病是由肠道病毒引起的传染病，多发生于5岁以下儿童，表现口痛、厌食、低热、手、足、口腔等部位出现小疱疹或小溃疡，多数患儿一周左右自愈，少数患儿可引起心肌炎、肺水肿、无菌性脑膜脑炎等并发症。个别重症患儿病情发展快，导致死亡。引发手足口病的肠道病毒有20多种（型），自2008年在新加坡的暴发流行，柯萨奇病毒A10型（CoxsackievirusA10，CA10）成为手足口病主要致病血清型之一，由其感染引起的手足口病爆发事件在法国、芬兰、印度等国家和地区不断被报道。2013年以前，中国多地区暴发流行的手足口病病原以EV71和CA16为主，CA6和CA10次之。2013年以后，CA10引起的手足口病比例逐渐上升，成为国内手足口病感染的优势病原体之一。CA10共分为A～G的7个基因型。目前国内外大多通过与周边地区或其他国家的流行株进行核苷酸和氨基酸的同源性对比，来分析CA10的流行情况。在我国，CA10近年来在多地区流行的病毒株保持着较高的同源性，与其他国家的分离株之间的同源性距离较远，具有地域分布特点以及一定的时间分布特点。CA10传染性强、隐性感染比例大、传播途径复杂、传播速度快，在短时间内可造成较大范围的流行，疫情控制难度大。

CA10病毒主要通过粪口途径传播，主要经胃肠道进入机体内。病毒在入侵的局部上皮细胞中完成增殖，然后病毒侵入局部淋巴组织中继续增殖并释放入血导致第一次病毒血症。病毒随血液传播接触到正常靶细胞。病毒表面的VP1蛋白与靶细胞表面特异性受体结合，完成吸附过程，其基因组RNA进入胞质。之后，病毒以其正链RNA作为模板，合成互补的负链RNA，又以负链RNA为模板合成病毒正链RNA，从而得到大量病毒RNA，进入子代病毒颗粒组装阶段。通过转录、翻译，复制出二代病毒，再次释放入血形成第二次病毒血症并引起临床症状。目前有大量研究表明，手足口病患儿的细胞免疫出现紊乱，并且这种免疫紊乱在重症与死亡病例中表现得更加严重。肺水肿被认为是感染的患儿中是最为严重的并发症之一，脑干的损伤则被认为是导致肺水肿的重要因素。很多研究表明参与细胞免疫的诸多炎性因子，例如IL-1、IL-6、IL-10、IL-13、IFN-γ、TNF-α的增加、T细胞亚群CD3+CD4+，以及自然杀伤细胞（NK）等，与肺水肿的发生具有相关性。

CA10易感染5岁以下年龄的幼儿，潜伏期多为2-10天。CA10感染儿童多引起轻型手足口病，患儿往往无明显的早期症状，大多数病人预后良好。临床上，往往表现为多发的斑丘疹和（或）疱疹，最多见于手足口、臂及膝关节。典型疱疹通常突出皮肤表面，呈现黄豆粒大小，圆形或椭圆形，其内液体混浊，常无疼痛和瘙痒感，约1周时间疱疹可自行消退，通常不留疤痕。病人或伴有发热、流涕、咳嗽、食欲不振、恶心、呕吐或腹泻等症状，一般能自愈，无后遗症。但少数儿童感染CA10后出现严重并发症，如脑膜炎、脑炎、急性弛缓性麻痹和神经呼吸综合征等。随着CA10流行程度的增加、重症病例的出现，开发针对性的抗病毒药物和疫苗成为当务之急，而建立稳定的CA10感染动物模型不仅是开发药物和疫苗的关键点之一，也为研究病毒的感染机制和机体免疫反应提供研究基础。

二、模型背景

1、CA10病毒信息

CA10属于小核糖核酸病毒科肠道病毒属；病毒颗粒呈20面体立体对称球形，直径为23-30µm，无包膜和突起，裸露的核衣壳由核酸和蛋白质组成。CA10基因组为单股正链RNA，全长约7.4 kb。CA10基因组两端为保守的非编码区，中间为一个独立的连续的开放阅读框架（ORF）。基因组的顺序依次为5'端非编码区，P1区、P2区、P3区和一段3'端非编码区。CA10病毒可用RD细胞培养，在37℃培养，48-96h达到高峰，在宿主细胞浆内增殖，迅速引起细胞病变，表现为细胞皱缩、变圆脱落，病毒颗粒破膜释放。CA10的感染可以诱导机体产生高低度的抗体，具有中和作用，能够抵抗再次的感染。同时血清中的抗体与其他肠道病毒间存在严重的交叉免疫反应。2013年以后，CA10引起的手足口病比例逐渐上升，成为国内手足口病感染的优势病原体之一。

2、实验动物背景信息

ICR小鼠毛色白化。适应性强，体格健壮，繁殖力强，生长速度快，实验重复性较好，雌鼠自发性畸胎瘤和管状腺瘤发病率为0%-1%，用氨基甲酸乙酯诱发时，11-16天胚胎期畸胎瘤和管状腺瘤发病率为5.9%，离乳个体管状腺瘤和囊瘤发生率为30%,孕鼠为3%。是国际通用的封闭群小鼠。外周血项和骨髓细胞，具有较好的稳定性，是良好的血液学实验用动物。是进行手足口病原研究的理想动物。

3、研究背景

随着CA10流行程度的增加、重症病例的出现，开发针对性的抗病毒药物和疫苗成为当务之急，而建立稳定的CA10感染动物模型不仅是开发药物和疫苗的关键点之一，也为研究病毒的感染机制和机体免疫反应提供基础。

目前国内的CA10病毒动物感染模型有泰山医学院的史卫峰教授课题组的ICR乳鼠感染模型，采用5日龄ICR乳鼠感染CA10细胞适应株TA151R，感染剂量为1.5X103TCID50，感染途径为肌肉注射（Protective Efficacies ofFormaldehyde-Inactivated Whole-Virus Vaccine and Antivirals in a Murine Modelof Coxsackievirus A10 Infection. Journal of Viology, 2017, Volume 91, Issue 13:e00333-17.）。