Armh4基因敲除心肌肥厚小鼠模型

Armh4基因敲除小鼠模型，采用的是基于CRISPR/Cas9技术的完全性基因敲除（Conventional Knockout,KO）。完全性基因敲除是把敲除目的基因的所有外显子或几个总要的外显子功能区敲除掉，获得全身所有的组织和细胞中都不表达该基因的小鼠模型。Armh4基因敲除小鼠模型为完全性基因敲除模型（KO），该模型应用范围广，可以制造针对各类疾病不同组织器官细胞的疾病模型。

CRISPR/Cas9技术的优点在于其对基因进行定位的精准编辑，在向导RNA（guide RNA，gRNA）和Cas9蛋白的共同作用下，细胞基因组DNA（被看成外源DNA）将被准确剪切。但是，被CRISPR/Cas9剪切需要满足几个条件。第一，待编辑的区域附近需要存在相对保守的PAM序列（NGG）。第二，向导RNA要与PAM上游的序列碱基互补配对。

模型动物饲养在武汉大学人民医院动物房SPF级动物实验室，实验动物使用许可证SYXK（鄂）2015-0027。

（1）建筑特点

门采用专用净化密闭门并配备观察窗。单向走道呈顺时针走向设计。屏障系统内共有大鼠饲养室1间，小鼠饲养室3间，隔离观察室1间，实验准备室1间，洁物存放室1间，清洗消毒室1间。此外，屏障系统外配有监控室、机房和配电室等。

（2）设计参数

室内温度：20～26°C；日温差：≤4°C；相对湿度：40%～70%；换气次数：15～20次/h；气流速度：≤0．2m/s；压强梯度：20～50Pa；空气洁净度：7级；菌落数：≤3个/皿；氨浓度：≤14mg/m3；噪声：≤60dB；Z低工作照度：≥200lx；动物照度：15～20lx；昼夜明暗交替时间：12/12h。

（3）通风和空调系统

动物实验室采用全新风中央空调通风系统。空气经过初、中、三级过滤器后进入实验室内环境。

（4）照明系统

一更、淋浴、二更、气闸、清洁走道、洁物存放处、污物走道、缓冲间和清洗消毒间、动物饲养室、实验准备间、隔离观察室和功能实验室等安装有手动和自动开关，根据实际需要，调节控制室内照明灯。未启用房间、清洁走道、洁物存放处、污物走道等在每日中午12点和晚上8点开启紫外线灯照射1h。

（5）通讯系统

因为SPF级动物实验室的环境和设施具有特殊要求，人员进入后不能随意出入，而室内外的联系又十分重要，故室内各房间均安装内部电话机，按照房间顺序编排电话号码，各室内电话可相互连通，并均与监控室总机保持联系，保证实验室内外信息的及时沟通。

（6）监控系统

对SPF级动物实验室的出入口、走道、实验动物饲养室、功能操作室等重要位置均安装了可作270°旋转的摄像机，能够及时了解设施的运行状态；也能有效督促实验人员执行科学的操作规程，避免人为因素造成室内环境和设施的污染；并对整个实验期间的动物状态和反应进行观察，减少对动物的滋扰。

（7）供水系统

SPF级实验动物饮用水以纯净水为宜。本实验室采用管道供水，将处理后的纯净水用塑胶管道输送到屏障系统内实验准备室，设置接水槽，为实验动物供应灭菌的饮用水和屏障系统内用水。要经常更换和清洗输水管道，清洗笼具的用水添加适当比例的84消毒液。

（8）供电系统、警报系统和消防设施

SPF级动物实验室要求全天候不间断供风和供电，如果出现故障，不能及时发现和处理，就可能导致环境设施的污染、动物感染或死亡，造成严重后果。因此应对SPF级动物实验室使用独立稳定的供电系统，并配备有应急电源。在中央空调机房控制室安装风机故障警报系统，以便及时检修和维护，保证设施的安全运行。

（9）消毒灭菌设备

为防止外界物品进入SPF级动物实验室时所携带的细菌污染室内环境和造成动物交叉感染，按照不同物品的特性，进行紫外线照射消毒、渡槽消毒液消毒或专用的机动门真空灭菌器消毒。

（10）动物饲养笼具

饲养大、小鼠的笼具聚碳酸脂材料的塑胶笼具，具有高透明、耐高压、耐高温、耐酸碱等特点。通用的不锈钢笼具长、宽、高分别为40、30、20cm，适用于单笼饲养有特殊要求的实验动物，配有底盘和食槽，确保实验动物有充足的采食和活动空间，同时也保证室内环境的清洁。

（11）垫料的选择和使用

在使用塑胶垫料时，垫料是大小鼠直接接触的铺垫物，起到吸湿、保暖和造窝的作用。垫料的好坏直接影响到大小鼠术后的恢复、生长发育和繁殖性能。目前，所使用的垫料主要有玉米秸垫料、刨花垫料。

（12）饲料配制

大小鼠的生产型饲料和维持型饲料必须严格按照国家标准，进行科学配制生产。每半年检测一次饲料的微生物指标和有效营养成分指标，保证饲料的质量。

1. 鉴定PCR结果图解 我们通过PCR都小鼠进行了鉴定，如图1，目前已经得到纯和子。

图1：ArmH4 KO小鼠鉴定PCR结果图。WT：407bp的条带；HOMO：255bp的条带；HET：407bp、255bp的条带。2. Armh4在PE诱导的新生大鼠心肌细胞肥大水平的作用

通过PE诱导构建新生大鼠心肌细胞肥大模型。qRT-PCR结果显示，过表达Armh4心肌肥厚标志物ANP、BNP表达量升高，表明过表达Armh4基因加重心肌肥厚（图2）。而敲低Armh4后结果显示，ANP、BNP表达量降低，表明敲低Armh4后减轻心肌肥厚（图2）。

图2.在新生大鼠心肌细胞中，分别过表达和敲除ArmH4基因对PE所诱导的心肌肥厚水平的影响。

野生型的八周龄年轻小鼠与22个月的衰老小鼠的心脏qRT-PCR结果表明，Armh4 mRNA水平显著升高（图3）。结合Armh4对心肌肥厚的影响，我们推测过表达Armh4会加速健康心脏衰老。

图3.ArmH4在年轻小鼠和衰老小鼠中的mRNA表达水平。

1.项目设计: 利用CRISPR/Cas9技术进行ARMH4 基因敲除小鼠构建。在共同的exon2的附近设计以NGG结尾的靶点，在CRISPR/Cas9作用下进行切割。

2．guideRNA信息:

Armh4 -sgRNA1：ATGGGAACTACTGTCGTTCCTGG

Armh4 -sgRNA2：CAACAGCTGGCAGTATTTTGGGG

3.构建PE诱导的心肌肥大细胞模型，检测ArmH4敲低后心肌肥厚分子标志物水平，分别提取总RNA，通过qRT-PCR检测心肌肥厚指标ANP、BNP的mRNA水平。

4. 取野生型的八周龄年轻小鼠与22个月的衰老小鼠的心，通过qRT-PCR检测Armh4 mRNA水平。

一、疾病概述 肥厚型心肌病 ( Hypertrophic cardiomyopathy) 是一种器质性心脏疾病，主要表现为左心室和(或)右心室及室间隔不对称肥厚、心室腔变小、心室顺应性降低。病因：肥厚型心肌病是常染色体显性遗传性疾病，60%～70%为家族性，30%～40%为散发性，家族性病例和散发病例、儿童病例和成年病例具有同样的致病基因突变。 临床表现： 1.以青壮年多见、常有家族史。 2.可以无症状，也可以有心悸、劳力性呼吸困难、心前区闷痛、易疲劳、晕厥甚至猝死，晚期出现左心衰的表现。 3.梗阻性肥厚型心肌患者胸骨左缘可出现粗糙的收缩中晚期喷射性杂音，可伴震颤，应用洋地黄制剂、硝酸甘油、静点异丙肾上腺素及Valsalva动作后杂音增强，反之应用β受体阻滞剂、去甲肾上腺素、下蹲时杂音减弱。有些病人闻及S3及S4心音及心尖区相对性二尖瓣关闭不全的收缩期杂音。 临床诊断：超声心动图提示左心室壁或（和）室间隔厚度≥15mm，排除了其他引起心肌肥厚的原因如高血压病、风湿性心脏病二尖瓣病、先天性心脏病（房间隔、室间隔缺损）及代谢性疾病伴发心肌肥厚。 二、模型背景1、Armh4基因信息• 敲除基因名称（NCBI号）：67419• 敲除基因NCBI网址链接：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/67419• 敲除基因名称（MGI号）：Armh4（MGI: 1914669）• 敲除基因Ensembl网址链接：http://asia.ensembl.org/Mus_musculus/Transcript/Summary?db=core;g=ENSMUSG00000036242;r=14:49675952-49783383;t=ENSMUST00000036972• 方案针对的转录本（Ensembl号）：ENSMUST00000036972.13• 方案敲除的exon：exon 22、实验动物背景信息 所采用的小鼠品系为C57BL/6。 来源：1921年立特(Little)用艾比·拉特洛坡(Abby Lathrop)的小鼠株，雌鼠57号与雄鼠52号交配而得C57BL1937年从C57BL分离出C57BL/6和C57BL/10两个亚系。1985年从Olac引到中国医学科学院实验动物研究所。 毛色：黑色。

主要特性：①乳腺肿瘤自然发生率低，化学物质难以诱发乳腺和卵巢肿瘤。②12%有眼睛缺损;雌仔鼠16.8%，雄仔鼠3%为小眼或无眼。用可的松可诱发腭裂，其发生率达20%。③对放射物质耐受力中等;补体活性高;较易诱发免疫耐受性。④对结核杆菌敏感。对鼠痘病毒有一定抵抗力。⑤干扰素产量较高。⑥嗜酒精性高，肾上腺素类脂质浓度低。对百日咳组织胺易感因子敏感。⑦常被认作"标准"的近交系，为许多突变基因提供遗传背景。

主要用途：是肿瘤学、生理学、免疫学、遗传学研究中常用的品系。3、研究背景 该动物模型的研究目的及意义；该动物模型的国内外研究进展并附参考文献。 肥厚型心肌病 ( Hypertuophic cardiomyopathy, HCM) 是一种器质性心脏疾病，主要表现为左心室和( 或) 右心室及室间隔不对称肥厚、心室腔变小、心室顺应性降低1。具有独特的病理生理特征和多种形态、功能和临床特征2。已有研究证明，HMC是常染色体显性遗传性疾病，60%～70%为家族性，30%～40%为散发性。虽然很多人认为肥厚性心机病是一种相对不常见的心脏疾病，但有研究表明，从以社区为基础的普通人群中选择的一大批明显健康的年轻人中，超声心动图结果判定的HCM，发病率高达0.2% 2。HMC最常见发生于10到25岁之间的青年人，是年轻、健康的个人和运动员猝死的主要原因2。当然心肌肥厚不仅涉及肥厚性心肌病，也是心力衰竭过程中代偿性机制的体现。 衰老，系指随着时间的增加，生命体功能衰退的过程3。寿命长用做低等模式生物评价衰老最重要的指标；而在高等动物中，细胞、组织与器官结构与功能复杂，单纯用寿命作为衰老的唯一指标并无全面，有研究认为，改善衰老相关疾病被认为是减轻衰老的表现4,5。衰老相关的系统性疾病包括：心脑血管疾病、肿瘤、骨关节炎、糖尿病与神经退行性疾病；相关研究也通常会记录衰老相关疾病的状态来评价个体衰老的情况6。在与年龄增长有关的疾病和失调中，最使人衰弱的疾病之一是丧失正常的心功能，从而导致心力衰竭7。左心室肥厚是心脏衰老的重要特征，可导致舒张功能不全和心力衰竭8。从逆转心肌肥厚的角度，探究是否能够减缓衰老的发生和发展。 β-连环蛋白（β-catenin）包含重复的~ 42个氨基酸序列,称为犰狳(Armadillo)重复,折叠在一起形成一个单一的、刚性的犰狳域(Armadillo domain, ARM)。含有ARM的蛋白质通常可以结合与细胞骨架构成相关的蛋白，如细胞接触和细胞骨架相关蛋白，以及通过产生和转导影响基因表达信号的传导功能9。ARM蛋白是一个庞大而多样的家族，包含犰狳重复或犰狳样螺旋结构域。我们筛选出的Armh4(Armadillo-like helical domain containing 4)为暂未明确特征的编码小鼠蛋白基因。与有文献报道Armh4在成人造血系统恶性肿瘤,通过抑制mTORC2的激酶活性，进一步负向调控STAT3信号通路，从而发挥抑制造血系统恶性肿瘤的作用10。另有研究报道，Armh4与心脏的发生有关11，Armh4是FHF（first heart field）和SHF（second heart field）心肌细胞衍生物的特异性标记物。总体上，目前关于Armh4的研究较少。 本研究通过在NRVM上过表达、敲低Armh4发现，过表达Armh4加重心肌肥厚，敲低改善心肌肥厚，并且对比年轻小鼠与衰老小鼠Armh4的mRNA水平，发现在衰老小鼠中Armh4的mRNA水平是上升的。而目前尚未报道Armh4在心肌肥厚发生过程中的作用，因此本项目拟探究Armh4对心肌肥厚的影响及探究其潜在的分子机制，为进一步治疗心肌肥厚相关疾病寻找治疗靶点；同时也探究Armh4对衰老的影响，是否存在通过对Armh4干预，延缓衰老。参考文献：1 Dadson, K., Hauck, L. & Billia, F. Molecular mechanisms in cardiomyopathy. Clin Sci (Lond) 131, 1375-1392, doi:10.1042/CS20160170 (2017).2 Maron, B. J. & Maron, M. S. Hypertrophic cardiomyopathy. The Lancet 381, 242-255, doi:10.1016/s0140-6736(12)60397-3 (2013).3 Lopez-Otin, C., Blasco, M. A., Partridge, L., Serrano, M. & Kroemer, G. The hallmarks of aging. Cell 153, 1194-1217, doi:10.1016/j.cell.2013.05.039 (2013).4 Kaeberlein, M., McVey, M. & Guarente, L. The SIR2/3/4 complex and SIR2 alone promote longevity in Saccharomyces cerevisiae by two different mechanisms %J Matt Kaeberlein;Mitch McVey;Leonard Guarente. 13 (1999).5 Rogina, B., Helfand, S. L. & Ames, B. N. Sir2 Mediates Longevity in the Fly through a Pathway Related to Calorie Restriction %J Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (2004).6 Childs, B. G. et al. Senescent cells: an emerging target for diseases of ageing. Nat Rev Drug Discov 16, 718-735, doi:10.1038/nrd.2017.116 (2017).7 Schocken, D. D. et al. Prevention of heart failure: a scientific statement from the American Heart Association Councils on Epidemiology and Prevention, Clinical Cardiology, Cardiovascular Nursing, and High Blood Pressure Research; Quality of Care and Outcomes Research Interdisciplinary Working Group; and Functional Genomics and Translational Biology Interdisciplinary Working Group. Circulation 117, 2544-2565, doi:10.1161/CIRCULATIONAHA.107.188965 (2008).8 Lakatta, E. G. & Levy, D. Arterial and cardiac aging: major shareholders in cardiovascular disease enterprises: Part II: the aging heart in health: links to heart disease. Circulation 107, 346-354, doi:10.1161/01.cir.0000048893.62841.f7 (2003).9 Tewari, R., Bailes, E., Bunting, K. A. & Coates, J. C. Armadillo-repeat protein functions: questions for little creatures. Trends Cell Biol 20, 470-481, doi:10.1016/j.tcb.2010.05.003 (2010).10 Lee, D. et al. Endogenous transmembrane protein UT2 inhibits pSTAT3 and suppresses hematological malignancy. J Clin Invest 126, 1300-1310, doi:10.1172/JCI84620 (2016).11 Conway, S. J., McConnell, R., Simmons, O. & Snider, P. L. Armadillo-like helical domain containing-4 is dynamically expressed in both the first and second heart fields. Gene Expression Patterns 34, doi:10.1016/j.gep.2019.119077 (2019).