Nipsnap2基因敲除心肌肥厚小鼠模型
讨论与结论
目前Nipsnap2蛋白及其所属的Nipsnap蛋白家族功能的研究较少，其模型中的作用未见报道，该项目属于原创性发现。此模型的建立为研究该基因提供了依据。我们研究发现，在动物水平上，敲除Nipsnap2基因，对心肌肥厚病理进程有显著的加重作用。通过对Nipsnap2基因功能的深入研究，将明确NIPSNAP2在心肌肥厚过程中调控代谢的分子机制，为通过代谢重塑临床防治心肌肥厚及心力衰竭提供新的实验证据及分子靶点。
生物安全性
模型动物饲养在武汉大学人民医院动物房SPF级动物实验室，实验动物使用许可证SYXK（鄂）2015-0027。
（1）建筑特点
门采用专用净化密闭门并配备观察窗。单向走道呈顺时针走向设计。屏障系统内共有大鼠饲养室1间，小鼠饲养室3间，隔离观察室1间，实验准备室1间，洁物存放室1间，清洗消毒室1间。此外，屏障系统外配有监控室、机房和配电室等。
（2）设计参数
室内温度：20～26°C；日温差：≤4°C；相对湿度：40%～70%；换气次数：15～20次/h；气流速度：≤0．2m/s；压强梯度：20～50Pa；空气洁净度：7级；菌落数：≤3个/皿；氨浓度：≤14mg/m3；噪声：≤60dB；Z低工作照度：≥200lx；动物照度：15～20lx；昼夜明暗交替时间：12/12h。
（3）通风和空调系统
动物实验室采用全新风中央空调通风系统。空气经过初、中、三级过滤器后进入实验室内环境。
（4）照明系统
一更、淋浴、二更、气闸、清洁走道、洁物存放处、污物走道、缓冲间和清洗消毒间、动物饲养室、实验准备间、隔离观察室和功能实验室等安装有手动和自动开关，根据实际需要，调节控制室内照明灯。未启用房间、清洁走道、洁物存放处、污物走道等在每日中午12点和晚上8点开启紫外线灯照射1h。
（5）通讯系统
因为SPF级动物实验室的环境和设施具有特殊要求，人员进入后不能随意出入，而室内外的联系又十分重要，故室内各房间均安装内部电话机，按照房间顺序编排电话号码，各室内电话可相互连通，并均与监控室总机保持联系，保证实验室内外信息的及时沟通。
（6）监控系统
对SPF级动物实验室的出入口、走道、实验动物饲养室、功能操作室等重要位置均安装了可作270°旋转的摄像机，能够及时了解设施的运行状态；也能有效督促实验人员执行科学的操作规程，避免人为因素造成室内环境和设施的污染；并对整个实验期间的动物状态和反应进行观察，减少对动物的滋扰。
（7）供水系统
SPF级实验动物饮用水以纯净水为宜。本实验室采用管道供水，将处理后的纯净水用塑胶管道输送到屏障系统内实验准备室，设置接水槽，为实验动物供应灭菌的饮用水和屏障系统内用水。要经常更换和清洗输水管道，清洗笼具的用水添加适当比例的84消毒液。
（8）供电系统、警报系统和消防设施
SPF级动物实验室要求全天候不间断供风和供电，如果出现故障，不能及时发现和处理，就可能导致环境设施的污染、动物感染或死亡，造成严重后果。因此应对SPF级动物实验室使用独立稳定的供电系统，并配备有应急电源。在中央空调机房控制室安装风机故障警报系统，以便及时检修和维护，保证设施的安全运行。
（9）消毒灭菌设备
为防止外界物品进入SPF级动物实验室时所携带的细菌污染室内环境和造成动物交叉感染，按照不同物品的特性，进行紫外线照射消毒、渡槽消毒液消毒或专用的机动门真空灭菌器消毒。
（10）动物饲养笼具
饲养大、小鼠的笼具聚碳酸脂材料的塑胶笼具，具有高透明、耐高压、耐高温、耐酸碱等特点。通用的不锈钢笼具长、宽、高分别为40、30、20cm，适用于单笼饲养有特殊要求的实验动物，配有底盘和食槽，确保实验动物有充足的采食和活动空间，同时也保证室内环境的清洁。
（11）垫料的选择和使用
在使用塑胶垫料时，垫料是大小鼠直接接触的铺垫物，起到吸湿、保暖和造窝的作用。垫料的好坏直接影响到大小鼠术后的恢复、生长发育和繁殖性能。目前，所使用的垫料主要有玉米秸垫料、刨花垫料。
（12）饲料配制
大小鼠的生产型饲料和维持型饲料必须严格按照国家标准，进行科学配制生产。每半年检测一次饲料的微生物指标和有效营养成分指标，保证饲料的质量。
评价验证
图1. Nipsnap2敲除鼠鉴定结果图杂合子：双带，其中一条带是缺失200bp；纯合子：单条带，两条带均缺失200bp。 2. 敲除Nipsnap2基因加重TAC所诱导的心肌肥厚水平 TAC手术四周后，Nipsnap2敲除鼠的心脏重量相比于sham组显著增大，左心室后壁厚度增加，并且在心肌肥厚进程加重（图2A-E）。心脏超声检测小鼠心脏结构和功能发现，敲除Nipsnap2后，加重了TAC手术导致的心肌肥厚，主要表现为左心室射血功能EF和FS的影响（图2D-E）。取各小组小鼠的心脏组织提取总RNA，结果如图2I-J所示，TAC手术后小鼠心肌肥厚标志物Anp和Bnp表达水平显著升高，Nipsnap2敲除后加重了这样的变化。
图2. 敲除Nipsnap2基因加重TAC所诱导的心肌肥厚水平
A-B．敲除Nipsnap2基因对小鼠心脏结构改变：A.小鼠心脏示意图；B.小鼠心脏整体重量与体重比值分析；
C-H．心脏超声检测Nipsnap2基因敲除小鼠心脏功能改变：C.TAC术后四周小鼠M型超声心动图；D.心脏超声检测的EF值结果；E.心脏超声检测的FS值结果；F. LVPWd (mm)为左心室舒张末后壁厚度；G.IVPWs(mm)；H.IVIDd (mm) ；
I-J．QPCR检测心肌肥厚的标志物Anp和Bnp在mRNA水平变化：I.Anp；J.Bnp。
Sham:假手术组；TAC：TAC手术组；WT：野生型小鼠；KO：Nipsnap2敲除鼠；*：p<0.05.
制备方法
1. 利用CRISPR/Cas9技术，设计并体外转录gRNA, 将Cas9、gRNA同时注射到小鼠的受精卵中。Cas9蛋白在gRNA引导下结合到靶位点进而造成DNA双链断裂，从而实现靶位点碱基序列缺失，实现基因敲除。guide RNA设计：
guideRNA信息:
· Nipsnap2（ko） -sgRNA1： TTGTCAGAAAGGTCGATCCAAGG
· Nipsnap2（ko） -sgRNA2： TTCAGTTCACAACGTTAAGCCGG
2. 建立主动脉缩窄建立小鼠心肌肥厚模型（TAC手术），通过超声心动图评价心脏功能，小鼠采用异氟脘吸入麻醉，将小鼠左胸前区剃毛，涂抹耦合剂，取仰卧位对小鼠行超声检查。采用高频超声诊断仪（VET V6，VINNO，中国），频率为12.5MHz，选取标准左心室乳头肌短轴切面，测量各项指标。
3．小鼠心脏组织切片形态及病理检测 称取小鼠体重，小鼠经心脏灌注，取出心脏后用滤纸吸干血液后称重，计算心脏重量与体重的比值（Heart weight/body weight，HW/BW）。
4．心肌肥厚分子标志物检测将各实验组小鼠心室肌组织分别提取总RNA，应用qPCR检测心肌肥厚指标Anp、Bnp、Myh6、Myh7的mRNA水平。
研究背景
模型信息
中文名称:Nipsnap2基因敲除心肌肥厚小鼠模型
英文名称:Mouse model of Nipsnap2 gene knockout cardiac hypertrophy disease
类型:心肌肥厚动物模型
分级:NA
用途:为通过代谢重塑临床防治心肌肥厚及心力衰竭提供新的实验证据及分子靶点。
研制单位:武汉大学
保存单位:武汉大学
