血小板NHE1基因条件性敲除小鼠模型

该模型的创新型和应用价值:

建立条件性基因敲除小鼠（血小板特异 NHE1-/-），更加准确的研究单因素（血小板 NHE1）对于盐敏感高血压的作用，提高了结果的可靠性，可能成为盐敏感性高血压防治的新模型。

动物模型制备过程中，由基因工程人员设计gRNA靶点及活性检测，NHE1flox/flox小鼠与条件性敲除小鼠的繁育和鉴定均由具有实验动物上岗证的专人完成，饲养人员进行日常饲喂，由兽医进行监督管理，造模期间动物状态良好，病死只数0，未使用微生物，对环境没有影响，造模方法可遗传。

1、血小板活化结果分析

2、生理生化结果分析

3、病理结果分析

4、血小板生成超微结构分析

1、模型设计原理：

GRNA介导Cas9蛋白剪切目标外显子两端的内含子DNA，同时提供同源模板Donor，基因组两端通过同源重组修复方式进行DNA修复，在特定外显子两端插入FloxP。 NHE1-FloxP小鼠与组织特异性表达Cre小鼠交配，从而实现NHE1基因条件性敲除的目的。实验采用最新的spCas91.1进行注射，减少了基因组中的off-Target。

2、动物模型制备

2.1NHE1floxp/flox小鼠鉴定PCR结果分析

2.2 NHE1flox/flox, Plt Cre小鼠测序结果分析

经鉴定1#和4#为NHE1flox/flox,Plt Cre 条件性敲除小鼠。

3. 标本采集及处理

条件性敲除小鼠2月龄后，称体重，麻醉后腹主动脉采血至死亡，室温静置2h后于4℃ 3000r离心10分钟提取血清，-80℃冰箱冻存。取心脏、主动脉做石蜡切片，10%中性福尔马林中固定，30%蔗糖脱水，冰冻切片包埋剂包埋并切片；进行免疫组化及免疫荧光检测，其余血管组织液氮冷冻-80℃保存，提取蛋白进行免疫印迹检测。

一、疾病概述

高血压是一种由环境因素、遗传因素和行为因素相互作用产生的复杂心血管症状，其中高盐摄入是最重要的环境因素之一。我国目前高血压患者已有2亿多人，其中盐敏感性高血压患者约占总患者的50%。所谓血压的盐敏感性是指相对高盐摄入所引起的血压升高，且往往伴随动脉粥样硬化、脑卒中、慢性肾病等更严重的靶器官损伤。目前约有62%的卒中事件和49%的心血管事件是由高血压直接引起的。盐敏感高血压病理机制复杂，动脉血管收缩及肾脏钠水代谢潴留被认为是主要发病机制之一。

我国目前抗高血压药物也主要通过舒张血管和利尿等方法降低血压，但遗憾的是药物治疗的患者仍有近半数没能有效控制血压，更缺乏对靶器官损伤及相关并发症的有效控制。

二、模型背景

1、造模因素信息

血小板NHE1基因条件性敲除小鼠模型

2、实验动物背景信息

C57BL/6小鼠

3、研究背景

近年研究显示慢性炎症反应在盐敏感高血压及心血管疾病发生中起重要作用。血小板活化引起的炎症反应是心血管疾病发生发展的重要因素。活化的 P-selectin 激活血小板并粘附于内皮细胞，形成单核细胞-血小板连接，促进白细胞化学趋化和内皮组织炎症浸润，对心血管疾病的发展起重要的推动作用[1]。

Na+/H+交换异构体1（NHE1）是一种膜结合蛋白，它通过介导细胞内外Na+ /H+离子交换，来维持机体PH平衡和细胞容积稳定。血小板表面广泛分布的 NHE1 在血小板活化中起重要作用。血小板 NHE1 通过介导细胞外Na+内流使得细胞中 Na+浓度升高，并通过NCX向细胞外泵出Na+交换性的增加血小板内的Ca2+浓度而激活血小板[2]。

已有研究发现高盐通过诱导血小板活化，参与了盐敏感高血压的发展。研究证实了盐敏感性高血压发生过程中，NHE1编码基因在多种组织中异常增高[3-5], 与盐敏感高血压的发展密切相关，可能是盐敏感高血压防治的新靶点。为证实血小板 NHE1是否是高盐诱导的炎症反应及盐敏感高血压的重要靶点，我们制备条件性基因敲除小鼠并进行了离体实验。结果显示，NHE1-/-小鼠血小板NHE1表达量显著低于对照小鼠，其血小板细胞经高浓度 NaCl（160mmol/L）溶液培养后，与对照组（正常浓度NaCl，133mmol/L）比较，血小板活化率不增加。

参考文献:

1. Rondina MT, Weyrich AS, ZimmermanGA. Platelets as cellular effectors of inflammation in vascular diseases.Circulation Research. 2013;112: 1506-151

2. Huber, J.D., Bentzien, J., Boyer,S.J., Burke, J., De, L.S., Eickmeier, C., Guo, X.,Haist, J.V., Hickey, E.R., Kaplita,P., Karmazyn, M., Kemper, R., Kennedy, C.A., Kirrane, T., Madwed, J.B., Mainolfi,E., Nagaraja, N., Soleymanzadeh, F., Swinamer,A., Eldrup, A.B., Identification ofa potent sodium hydrogen exchanger isoform 1

(NHE1) inhibitor with a suitableprofile for chronic dosing and demonstrated cardioprotective effects in apreclinical model of myocardial infarction in the rat J. Med. Chem. 2012;55: 7114-7140.

3. Farjah M1, Roxas BP, Geenen DL,Danziger RS, Dietary salt regulates renal SGK1 abundance: relevance to saltsensitivity in the Dahl rat. Hypertension. 2003;41(4):874-8.

4. Gerhold D1, Bagchi A, Lu M,Figueroa D, Keenan K, Holder D, Wang Y, Jin H, Connolly B, Austin C,Alonso-Galicia M.Androgens drive divergent responses to salt stress in male versus femalerat kidneys.Genomics. 2007;89(6):731-44.

5. Rose P1, Bond J, Tighe S, TothMJ, Wellman TL, Briso de Montiano EM, Lewinter MM, Lounsbury KM.Genesoverexpressed in cerebral arteries following salt-induced hypertensivedisease are regulated by angiotensin II, JunB, and CREB.Am J Physiol Heart CircPhysiol. 2008;294(2):H1075-85.