IFITM6敲除小鼠模型

该模型的鉴与评价技术方法和指标体系包括（1）分子水平：模型鼠基因型及mRNA表达应符合5.1和5.2中指标要求。（2）细胞水平：该基因过表达对细胞增殖影响应符合5.3中指标要求。（3）整体水平：模型小鼠造血干细胞对TBI和竞争性移植的影响应符合5.4、5.5中指标要求。。

在病毒感染引起的先天性免疫应答，IFITM家族在其中起重要作用，但是关于该家族在其他方面的研究相对较少。通过前期的大数据分析，发现IFIMT6可能在造血干细胞的发育分化、衰老过程中发挥作用，为探明该基因在造血干细胞中的作用和机制，我们建立了该基因的敲除小鼠模型，通过初步研究发现该基因缺失，在正常情况下，分析造血干细胞分化发育的各谱系细胞，并未发现明显差异，但是在TBI引起的造血干细胞损伤中起保护作用，并且通过竞争性移植实验发现该基因缺失，能够增强其竞争性能力，表明该基因缺失可能在外界刺激的情况下起保护作用，但是具体机制还需要进一步深入研究。

该基因敲除小鼠模型的建立，为该基因功能研究、病毒引起的先天性免疫应答研究、造血干细胞的功能研究等提供动物模型支撑。

模型制作及动物实验中涉及动物的操作程序已获得中国医学科学院医学实验动物研究所实验动物使用与管理委员会的批准，批准号为ZLF18004。本实验部分使用了基因修饰动物（基因敲除），只在规定的SPF级动物设施内饲养，饲养过程有防逃逸的措施，如挡鼠板等。动物在离开动物设施后，进行完相关试验后，立即进行处死，取材。动物尸体暂存于-20℃冰箱中，经有资质的公司运走统一处理。

4.1 IFITM6主要定位于细胞膜上 构建过表达IFITM6-Flag质粒，转染293T细胞，通过用抗Flag抗体进行免疫荧光染色，结果表明IFITM6主要定位于细胞膜上（图3A）。并对K562细胞中家族其他基因分析，发现IFITM1和IFITM2表达相对较高（图3B），IFITM6过表达影响细胞增殖（图3C）

图3所示 在K562细胞中过表达影响细胞增殖

4.2 IFITM6敲除小鼠的建立

利用CRISPR/Cas9在IFITM6基因第二外线子选择gRNA靶点，敲除第二外显子。出生的小鼠经过设计包含靶点的引物（Table1），进行基因型鉴定，并进行插入序列的测序，最终获得了敲除第二外显子的小鼠，如图3-a所示。随后，我们通过杂合子杂交的方式获得了纯合敲除小鼠，并进行了表达分析，图3-c显示。结果表明我们成功建立了该基因的敲除小鼠模型。

图3 IFITM6敲除小鼠的建立

Table 1 本文中用于基因型鉴定的引物信息

4.3 IFITM6敲除对家族其他成员的影响

我们分析了IFITM6敲除对家族其他成员的影响，结果表明IFIMT6敲除小鼠中，IFITM1表达升高，IFITM2和IFITM5表达下降，IFITM3表达变化不明显（图4所示）。

图4 IFIMT6敲除对IFIMT家族其他成员表达的影响

4.4 IFITM6敲除影响LT-HSC

我们对该基因的敲除小鼠进行了造血干细胞分化、发育相关的流式分析，结果表明基因缺失对LSK影响不明显，但对LT-HSC有促进作用，但是LT单克隆培养实验发现，敲除后会造成克隆形成数减少，但不影响克隆大小和形态（图5所示）。

图5 IFITM6敲除影响HSC功能

4.5 IFITM6敲除在辐射引起的损伤（TBI）中起保护作用

我们对该基因敲除小鼠进行了辐射引起的损伤（TBI）实验，结果显示IFITM6敲除在TBI实验中起保护作用，并且克隆形成能力明显增加（图5所示）。

图6 IFITM6敲除在TBI实验中起保护作用

4.6 IFITM6敲除影响骨髓竞争性移植

我们通过竞争性移植实验，初步分析发现，IFITM6敲除在竞争性移植中起保护作用（图7所示）。由于动物目前数量较少，需要进一步增加动物数量进一步核实。

图7 竞争性移植实验

5.1基因型鉴定

该模型鼠是通过CRISPR技术，将IFITM6的第二外显子敲除，，因此，在基因水平鉴定，需要区分野生型、杂合子和纯合子，鉴定引物为Table1中所列。

5.2基因表达情况

对敲除鼠组织取材，通过Q-PCR检测检测不到IFITM6基因的表达。

5.3 过表达K562细胞增殖的影响

该基因的表达主要定位于细胞膜上，过表达会影响K562细胞的增殖。

5.4 在TBI中的作用

该基因敲除在TBI引起的造血干细胞损伤过程中起保护作用。

5.5 该基因敲除对竞争性移植的影响

该基因敲除后，通过竞争性移植实验，敲除细胞在受体鼠中占具数量优势。

3.1 实验材料

3.1.1 实验动物

C57BL/6购自北京维通利华实验动物技术有限公司 SCXK(京）2016-0006。超排用雌鼠数量10-15只，年龄3周龄，交配传代用野生型鼠为成年8-10周龄小鼠。实验中基因工程小鼠由本实验室繁殖产生。实验中涉及动物的操作程序已获得中国医学科学院医学实验动物研究所实验动物使用与管理委员会的批准，批准号为ZLF18004.

3.1.2实验仪器

3.1.3实验试剂

3.1.4 模型构建流程 利用CRISPR/Cas9技术制备IFITM6敲除小鼠。选择敲除第二外显子，来构建IFITM6敲除小鼠 (B6. IFITM6 (tm)-GC/ILAS)。该基因敲除的杂合子小鼠，相互杂交可以获得该基因敲除的纯合子小鼠，使用PCR方法进行基因型鉴定。3.1.5 IFITM6敲除小鼠的建立3.1.5.1 IFITM6敲除小鼠模型的建立(1) 设计方案

(2) 构建sgRNA 载体pUC57-sgRNA expressionvector，根据基因信息选择靶点并合成sgRNA。

靶点1:

M-Ifitm6-EA1-g-up: TAGGACTGGGATCTGGTATAGG

M-Ifitm6–EA1-g-down: AAACCCTATACCAGATCCCAGT

靶点2:

M-Ifitm6-EB1-g-up: TAGGGAGAATGCCCAGGGATTC

M-Ifitm6–EB1-g-down: AAACGAATCCCTGGGCATTCTC合成的sgRNA单链通过退火复性结合成小片段，插入BSA I线性化的载体，构建完成的sgRNA载体通过体外转录成为可注射的sgRNA。

(3) 构建Cas9载体pST1374-NLS-flag-linker-Cas9，载体通过体外转录成为可注射的Cas9-RNA。

(4) 显微注射

1) 超数排卵：10-15只3周龄雌鼠注射激素进行超排。

2) 受精卵注射：取约120枚受精卵进行注射。

3) 受体鼠制备：8-10周龄雌鼠与结扎的SD雄鼠交配后选取见栓的雌鼠。

4) 胚胎移植：将注射后的受精卵移植到受体鼠输卵管壶腹部（移植一次，120枚卵，5只受体鼠）。

(5) 基因型鉴定

1) 剪尾编号：出生7-10天的乳鼠，剪取脚趾和尾尖进行编号及取材。

2) 基因组DNA提取：使用基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA

3) PCR检测：根据序列信息设计检测引物并进行PCR检测。

(6) 结果分析：选取通过PCR检测后含有不同于野生型分子量条带的鼠号，将PCR产物进行TA克隆，之后用检测引物进行菌液PCR，筛选有插入的克隆测序。

(7) 根据测序结果确定IFITM6敲除小鼠模型(B6.IFITM6 (tm)-GC/ILAS)用于后续实验。

3.1.5.2 动物繁殖和表达图谱分析

获得F0代后，首先通过与野生型鼠进行杂交，进行基因修饰鼠传代能力分析。获得能够传代的杂合子小鼠进行相互杂交，产生纯合敲除小鼠并用于后续实验。

图 2. IFITM6敲除小鼠的繁育

3.1.5.3 鼠尾基因组DNA提取

在幼崽出生后剪脚趾标记，收集幼崽脚趾至1.5 mL EP管。然后参照DNA提取试剂盒（全式金）说明书按以下程序操作。

(1) 加入100μL LB2和20 μL Proteinase K，55℃摇床孵育至完全裂解。

(2) 12000rpm 离心5min，转移上清于一无菌的离心管中。

(3) 加入500μLBB2，立即涡旋5s，室温孵育10min。

(4) 将全部的溶液加入离心柱中，8000rpm离心1min，弃掉流出液。

(5) 加入500μL CB2溶液，12000 rpm离心1min，弃掉流出液。

(6) 重复步骤（5）一次。

(7) 加入500μL WB2（使用前加入88 mL无水乙醇），12000rpm 离心1min，弃掉流出液。

(8) 重复步骤（7）一次。

(9) 10000rpm 离心2min，彻底去除残留的WB2。

(10) 将离心柱置于一干净的离心管中，开盖静置5min，在柱的中央加入50~200μL预热EB（60℃~70℃），盖上盖子，室温静置3min，12000rpm 离心2min，洗脱DNA。保存至4℃冰箱。

一、疾病概述

固有免疫是机体防御外来病毒感染的第一道防线，通过识别病原并产生各种细胞因子、趋化因子、干扰素（IFN）等多种抗病毒因子。干扰素诱导的跨膜蛋白（IFITM家族），是一类具有抗病毒作用的ISG（干扰素诱导基因）的编码产物，并证明其在多种生物过程中发挥作用，具有广泛的抗病毒作用，并在免疫信号转导、细胞归巢等发挥作用。

IFITM家族包括IFITM1、IFITM2、IFITM3、IFITM5、IFITM6、IFITM7和IFITM10，除了IFITM5特异性表达与骨细胞，不依赖与IFN的表达，其余家族在IFN的调控下在多组织和器官广泛表达。其中，FITM1、IFITM2、IFITM3、IFITM5和IFITM10在人类中表达，FITM1、IFITM2、IFITM3、IFITM5和IFITM6在小鼠中表达（图1）。

图1 IFITM家族成员 （a）人和小鼠的IFITM家族成员差异比较（b）IFITM家族的跨膜形式。

IFITM家族具有两个输水区，被一个称为保守型细胞内环结构（CTL）保守区分开。IFITM在不同组织和细胞中，分布相对广泛。IFITM1主要位于细胞膜和早期内体，能够与细胞表面分子CD19和CD81相互作用。报道显示CD81是HCV的受体，表明IFITM1可能与HCV感染进入细胞存在相关性。IFITM2和IFITM3主要存在于晚期内体和溶酶体，并于Ras相关蛋白RAB7、CD63和LAMP1共定位。通过功能基因组筛选，发现IFIMT1、IFIMT2、 IFIMT3，能够被1型和2型IFN诱导表达，并对于IFN抑制流感性病毒发挥重要作用。IFITM3基因敲除小鼠模型，在感染流感病毒后引起爆发性病毒肺炎，重新基于IFIMI3可以逆转病情。已有的研究还表明IFIMT家族还参与Th1和Th2细胞的分化调节（图2所示）。IFIMT5参与成骨细胞和矿物盐沉积。IFITM10在不同物种中的同源非常高，高达85%以上，但是功能仍是未知。通过敲除小鼠的IFITM3, IFITM5，和IFITM 6基因后，发现能够影响Th1细胞的分化，但是IFITM6的具体功能仍不清楚。

图2 IFTIM家族参与Th1和Th2的分化调节

IFITM作为固有免疫系统IFN效应的重要元件，在病毒性疾病的防御过程中发挥重要作用。由于IFITM参与调节机体的固有免疫，在病毒引起的疾病机制中具有重要作用。IFITM敲除的小鼠在Th2设计的免疫病理和应答中起保护作用。IFITM家族作为抗病毒治疗的有效靶点，能够抑制病毒入胞和复制，这对病毒感染相关疾病的预防和治疗提供可能的新的药物靶点。

1、基因信息

干扰素诱导膜蛋白6（interferon induced transmembrane protein 6 ，Ifitm6，GENE ID：213002），由IFITM6基因所编码，功能不明确，可能在Th2细胞的分化过程中起作用。

细胞：K562细胞（人类红白血病细胞系），源自一个53岁的女性慢性髓性白血病爆发期病人的淋巴母细胞。293T细胞，人肾上皮细胞系，同时表达 SV40 大 T 抗原。

2、实验动物背景信息

实验所用小鼠（C57BL/6）背景。C57BL/6小鼠也被称为C57 black6，也称作B6。1921年被培育出来，属于近交品系。该品系的最主要的两个特点就是品系稳定和易于繁殖。主要用途包括：作为生理学与病理学的实验动物模型、构建转基因动物模型、作为产生自发突变和诱发突变的同基因型小鼠的背景品系。该品系在国内使用频率高，价格相对便宜。

3、研究背景

在固有免疫系统中，IFITM作为固有免疫系统IFN效应的重要元件，在病毒性疾病的防御过程中发挥重要作用。除在固有免疫系统中发挥作用，IFITM家族还参与其他生理功能，如IFIMT5参与成骨细胞和矿物盐沉积。我们在前期工作中，通过造血干细胞的高通量测序和表达分析，筛选到基因IFITM6，表明该基因可能在造血干细胞的相关的生物学功能中发挥作用。IFITM6在小鼠造血干细胞中是否发挥作用，以及拥有怎样的生物学功能，需要进一步研究进行阐述。

目前尚没有IFITM6的基因敲除小鼠，构建该基因的敲除小鼠，分析该基因敲除后的表型以及在造血干细胞中的功能，该项目不仅为该基因在造血干细胞中的功能提供实验基础，同时也为该基因在病毒感染的先天性免疫机制研究中提供动物模型。

参考文献：

【1】Yánez DC, Ross S, Crompton T. The IFITM protein family in adaptive immunity.Immunology. 2020 Apr;159(4):365-372. doi: 10.1111/imm.13163. Epub 2019 Dec 22.

【2】Yánez DC, Sahni H, Ross S, Solanki A, Lau CI, Papaioannou E,Barbarulo A, Powell R, Lange UC, Adams DJ, Barenco M, Ono M, D'Acquisto F,Furmanski AL, Crompton T. IFITM proteins drive type 2 T helper celldifferentiation and exacerbate allergic airway inflammation. Eur J Immunol.2019 Jan;49(1):66-78. doi: 10.1002/eji.201847692. Epub 2018 Nov 9.

【3】Smith S, Weston S, Kellam P, Marsh M. IFITM proteins-cellularinhibitors of viral entry. Curr Opin Virol. 2014 Feb;4:71-7. doi:10.1016/j.coviro.2013.11.004. Epub 2014 Jan 28.

【4】Shi G, Ozog S, Torbett BE, Compton AA. mTOR inhibitors lower an intrinsicbarrier to virus infection mediated by IFITM3. Proc Natl Acad Sci US A. 2018 Oct 23;115(43):E10069-E10078. doi: 10.1073/pnas.1811892115. Epub 2018Oct 9.

【5】Li K, Markosyan RM, Zheng YM, Golfetto O, Bungart B, Li M, Ding S,He Y, Liang C, Lee JC, Gratton E, Cohen FS, Liu SL. IFITM proteins restrictviral membrane hemifusion. PLoS Pathog. 2013 Jan;9(1):e1003124. doi:10.1371/journal.ppat.1003124. Epub 2013 Jan 24.

【6】Zhao X, Li J, Winkler CA, An P, Guo JT. IFITM Genes, Variants, and Their Roles in the Control andPathogenesis of Viral Infections. FrontMicrobiol. 2019 Jan 8;9:3228. doi: 10.3389/fmicb.2018.03228. eCollection 2018.

【7】Hickford D, Frankenberg S, Shaw G,Renfree MB. Evolution of vertebrate interferon inducible transmembraneproteins. BMC Genomics. 2012 Apr 26;13:155. doi: 10.1186/1471-2164-13-155.

【8】Rodriguez Celin M, Moosa S, Fano V. UncommonIFITM5 mutation associated with severe skeletal deformity in osteogenesisimperfecta. Ann Hum Genet. 2018 Nov;82(6):477-481. doi: 10.1111/ahg.12275. Epub2018 Jul 24.

【9】Lazarus S, McInerney-Leo AM, McKenzie FA, Baynam G, Broley S, CavanBV, Munns CF, Pruijs JE, Sillence D, Terhal PA, Pryce K, Brown MA, Zankl A,Thomas G, Duncan EL. The IFITM5 mutation c.-14C > T results in an elongatedtranscript expressed in human bone; and causes varying phenotypic severity ofosteogenesis imperfecta type V. BMC Musculoskelet Disord. 2014 Mar 27;15:107.doi: 10.1186/1471-2474-15-107.

【10】Hanagata N, Li X, Morita H, Takemura T, Li J, Minowa T. Characterizationof the osteoblast-specific transmembrane protein IFITM5 and analysis ofIFITM5-deficient mice. J Bone Miner Metab. 2011 May;29(3):279-90. doi:10.1007/s00774-010-0221-0. Epub 2010 Sep 14.