铁过载小鼠的活动性结核病模型

腹腔注射中等剂量（7.5 mg/次，3 次/周，共 4 周）右旋糖酐铁溶液可成功构建外源性铁过载小鼠模型，通过尾静脉注射 Mtb 可构建活动性结核病铁过载小鼠模型。模型评价的主要指标是铁过载小鼠外周血血清铁和铁蛋白水平，以及各脏器组织 HE与普鲁士蓝染色来确证。铁过载的结核动物模型主要通过组织荷菌量和病变来综合评价。

本模型中铁过载模型参考文献报道的方法，而铁过载的小鼠结核模型采用本研究室结核模型制备方法，目前未见报道。

该模型模拟临床上先天性代谢障碍导致体内铁过度蓄积；同时，持续性大量输血、长期内服铁剂或某些血液性疾病均可导致机体铁负荷过载患者，可用于研究铁过载对机体抗结核免疫应答损伤机制，以及铁过载如何促进巨噬细胞内 Mtb 的生长及其在 TB 的发生发展机制。

动物模型的制备的设计得到研究所IACUC委员会的批准，人员都是训练有素的研究人员和实验人员，全程在ABSL-3实验室中进行，完全按照模型制备和检测的一系列SOP操作进行，遵守生物安全操作要求，无安全事故。

1、 表型分析

1.1 铁过载小鼠组织形态及体重评估

铁过载小鼠外观与正常小鼠无明显区别，自主活动稳定，精神状态平稳。解剖后正常小鼠各脏器组织表面光滑，无充血、水肿。铁过载小鼠肝脏颜色呈暗褐色，且随着右旋糖酐铁剂量增加而逐渐加深，其他脏器组织无明显颜色及形态 变化（图 1）。低剂量组、中剂量组与阴性对照组相比体重增长无显著差异。高剂量组体重增长略有减缓，且与其他剂量实验组及阴性对照组比较差异有明显统计学意义( 图 2，P ＜ 0.05)。

图 1. 不同剂量铁过载小鼠肝脏变化

图 2. 不同剂量铁过载小鼠体重增长百分比

*表示高剂量组与低剂量组、中剂量组及阴性对照组比较，P ＜0.05。

2.2 铁过载小鼠组织铁含量变化

铁过载小鼠中肝组织含铁量最高，与阴性对照组小鼠相比增加接近 7 倍。其次，组织铁含量由高至低依次为脾脏，肾脏及小肠。高剂量组和中剂量组各脏器组织铁含量均显著高于阴性对照组（图 3，P 均 ＜ 0.05），低剂量组小鼠心脏和肺组织铁含量显著低于其他剂量组，与阴性对照组相比无显著性差异（图 3， P ＞ 0.05）。

图 3. 不同剂量铁过载小鼠组织含铁量

*表示各不同剂量组与阴性对照组比较，P ＜0.05；**表示各不同剂量组与阴性对照组比较，P ＜0.01。

2.3 铁过载血生化指标变化

铁过载小鼠分别于铁剂注射 4 周后取外周血血清进行血清铁、铁蛋白、转铁蛋白和可溶性转铁蛋白受体检测，结果如图 4 所示。阴性对照组和各不同剂量铁剂组小鼠血清铁水平分别为19.95 ± 5.64 μmol/L、43.00 ± 6.82 μmol/L、65.84 ± 167 9.31 μmol/L 和 108.45 ± 9.90 μmol/L，组间差异有明显统计学意义 (图 4，P 均 ＜ 0.05) 。进一步检测各组动物外周血铁蛋白水平分别为 773.82 ± 161.51 μg/L、 169 1063.68 ± 65.15 μg/L、1344.08 ± 168.57 μg/L 和 1694.73 ± 44.45 μg/L，组间差异同样有明显统计学意义( 图 4，P 均 ＜ 0.05) 。然而，各剂量组小鼠转铁蛋白和可溶性转铁蛋白受体水平与正常对照组小鼠相比均无显著差异（图 4，P ＞ 0.05）。

图 4. 不同剂量铁过载小鼠血清铁、铁蛋白、转铁蛋白和可溶性转铁蛋白受体水平

(a)：血清铁，(b)：血清铁蛋白，(c)：血清转铁蛋白，(d)：血清可溶性转铁蛋白受体。*表示各不同剂量组与阴性 对照组比较，P ＜0.05；**表示各不同剂量组与阴性对照组比较，P ＜0.01。

3、病理表型

铁过载小鼠组织HE 染色与铁染色铁过载模型中高剂量组小鼠肝脏、脾脏和肾脏组织HE 染色均可见大量团状含铁血黄素沉积。肝细胞核固缩、溶解，胞浆内满布蛋白微粒；脾小体与红髓区界限不清；小肠及心脏组织可见部分含铁血黄素沉积，心肌纤维出现排列异常，炎性细胞浸润，充血水肿、出血等病理变化；肺部可见小数铁蛋白微粒，支气管和血管周围及其管腔内炎性细胞浸润，嗜酸性粒细胞及淋巴细胞渗出，并可见肺泡不均匀扩张，肺泡间隔断裂等。中剂量组和低剂量组仅肝脏和脾脏可见含铁血 黄素沉，且含铁血黄素沉程度与铁剂量成正相关；心脏、肺、肾脏及小肠等组织未见明显含铁血黄素沉积及炎性细胞浸入，与阴性对照组相比无明显变化（图6）。普鲁士蓝染色与组织铁含量测定结果一致，阴性对照组小鼠各组织铁染色为阴性，高剂量组小鼠心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏和小肠等组织大量胞外铁和胞内铁呈颗粒状、块状亮蓝色铁沉积。中剂量组肝脏和脾脏组织铁沉积较明显， 心脏、肺、肾脏和小肠仅可见小量铁沉积，均未见组织形态改变。低剂量组小鼠中心脏和肺组织则未见明显铁沉积，与阴性对照组相比无显著改变（图 7）。

图 6. 不同剂量铁过载小鼠组织 HE 染色（× 20）

图 7 不同剂量铁过载小鼠各组织普鲁士蓝染色（× 20）

图 7. 结核感染铁过载小鼠肺脾肝组织病理变化（× 20）

4.铁过载结核病小鼠组织荷菌量

对中剂量右旋糖酐铁建立的铁过载小鼠模型进行 Mtb 感染试验，感染后 4 周解剖并进行肺、脾和肝脏病理分析和荷菌量检测，结果表明铁过载结核病小鼠构建成功。如图 7 所示，肺脾及肝组织病理 HE 染色中铁过载 Mtb 感染组肺组织出现多处炎症反应，呈实变趋势，其中肺泡壁增厚，肺泡腔被淋巴细胞等炎症细胞填充。结核性肉芽肿显著增加且多于空白 Mtb 感染组。脾脏白髓被结核肉芽肿病变破坏，可见炎症细胞聚集，且病变较重。同样，铁过载 Mtb 感染小鼠肝脏可见水肿、淤血，光镜下肝细胞内可见团块状铁褐色沉积，Mtb 感染后出现多个散在小肉芽肿样病变。同时，感染小鼠肺、脾脏和肝组织荷菌量比较发现，铁过载 Mtb 感染组荷菌量比空白 Mtb 感染组各靶器官较高，且具有统计学差异（图 8，P 均 ＜ 0.05）。

图 8 结核感染铁过载小鼠肺脾肝组织荷菌量分析

1.1实验材料

C57BL/6N 小鼠（北京维通利华，SCXK (京)-2016-0006），右旋糖酐铁注射液（江西创导动物保健品有限公司），血清铁、铁蛋白、转铁蛋白及可溶性转铁蛋白受体检测试剂盒（酶免公司），组织铁检测试剂盒（南京建成生物工程研究所），普鲁士蓝染色试剂盒（Solarbio），结核分支杆菌标准株 H37Rv（菌号为 93009，本室保存），中性罗氏培养管（珠海贝索生物），BACTEC MGIT 7H9 98 分支杆菌快速培养管（BD 公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 铁过载小鼠模型建立

6~8 周龄 SPF 级雌性 C57BL/6N 小鼠随机分成阴性对照、低剂量、中剂量和高剂量 4 个小组，实验组分别腹腔注射右旋糖酐铁3.75、7.5、15 mg/次，阴性对照组小鼠腹腔注射等体积生理盐水，3 次/周，共计 4 周。定期观察小鼠生长及精神状态，称重并记录。动物实验经本所实验动物管理和使用委员会（IACUC）批准，批准号为：ZLJ2019001。

1.2.2 血清生化指标与组织铁含量测定

建模完成后将小鼠摘眼球采血，4 ℃凝结过夜，2000 g 4 ℃离心 10 min，分离小鼠血清并检测血清铁、铁蛋白、转铁蛋白及可溶性转铁蛋白受体含量。解剖取小鼠心脏，肝脏、脾脏、肺、肾脏及小肠等组织器官，称重后加 1ml 生理盐水充分研磨并裂解组织碎片，12000 g4 ℃离心 20 min，取上清并测定蛋白浓度。血清生化检测按试剂盒说明书进行，组织铁测定则按试剂盒测定方法计算相同蛋白浓度下各组织铁含量。

1.2.3 铁过载小鼠 Mtb 感染

SPF 级 C57BL/6N 随机分成空白对照组、空白 Mtb 感染组、中剂量铁过载模型组和中剂量铁过载模型 Mtb 感染组，每组 6 只。其中 Mtb 感染组小鼠经尾静脉注射对数生长期 H37Rv 单细胞菌悬液 100 μl（1×10 6 CFU/ml），空白对照组注射等剂量无菌生理盐水。本所 ABSL-3 实验室（国卫 ABSL3-059）正常饲喂， 观察并记录小鼠临床表现，感染后 4 周解剖小鼠。

1.2.4 小鼠组织荷菌量测定

ABSL-3 实验室动物解刨台中解剖感染小鼠，无菌取小鼠肺、脾和肝脏组织；拍照记录肺、脾和肝脏等器官大体病变情况，取小鼠左肺、脾头及肝小叶于生物安全柜内称重，依次经 2%稀硫酸溶液、生理盐水漂洗 30 s，1 ml 生理盐水温和匀浆后进行 10倍倍比稀释，分别取 10-3，10-4和 10 -5 稀释液 50 µl 均匀涂布于中性罗氏培养管内，37℃培养 4 周，计算相应的组织器官荷菌量。另取 10 -1稀释液 500 μl 接种于 BD BACTEC MGIT 960 培养系统，通过记录报阳时间进行结核菌的快速检测。

1.2.5 组织切片

HE染色与铁染色 小鼠各组织器官，10%中性福尔马林溶液固定 48 h。组织按长轴最大横切面修块、梯度乙醇脱水、石蜡包埋并切成 5 µm 厚度切片，HE 染色后扫描载玻片并保存为 NanoZoomer 数字病理图像，不同视野下拍照并进行组织病理学分析。铁染色组织切片脱蜡至水，切片入 Perls 染液浸染 20 min，蒸馏水充分冲洗切片5 min，入核固红染色液，淡染细胞核 10 min，自来水冲洗 5 s。常规脱水透明，中性树胶封固，晾干后拍照观察其病理形态改变及铁沉积程度。

1.3 统计学分析

SPSS16.0 进行统计学处理，结果以平均数±标准差表示。不同实验处理组之间差异比较采用单因素方差分析，P ＜ 0.05 为差异有统计学意义。柱形图采用 GraphPad Prism 5 软件制作。

一、疾病概述

结核病是由结核分支杆菌（结核菌）引起的一种慢性传染性疾病，结核感染通常会累及肺、淋巴系统及其它多组织器官。除少数发病急促外，临床上多呈慢性过程。常有低热、乏力等全身症状和咳嗽、咯血等呼吸系统表现。感染后潜伏期4～8周，其中80%发生在肺部，其他部位（颈淋巴、脑膜、腹膜、肠、皮肤、骨骼）也可继发感染。

排菌的肺结核患者是传染源,人与人之间呼吸道传播是本病传染的主要方式。大多数的受感染者没有病症，称为潜伏结核感（latentTBinfection），但其中约5-10%的潜伏感染者会发展至活动性结核；若无适当治疗，一个活动病例平均每年可使10～15人新受感染，病例本人的死亡率则超过50%。若潜伏感染者同时罹患免疫抑制，如艾滋病，每年就有10%的病发机率。

肺结核病程较复杂，临床分型有：1、原发型肺结核(Ⅰ型): 肺内渗出病变、淋巴管炎和肺门淋巴结肿大的哑铃状改变的原发综合征。儿童多见，仅表现为肺门和纵隔淋巴结肿大。 2、血型播散型肺结核(Ⅱ型):包括急性血型播散型肺结核及亚急性、慢性血型播散型肺结核。 3、继发型肺结核(Ⅲ型):可以出现以增殖为主、浸润为主、干酪病变为主或以空洞为主等多种病理改变。

结核菌进入机体后，被巨噬细胞吞噬，结核菌毒力与宿主免疫力的抗衡决定着结核发病、发展和转归。结核病从感染、发病到转归均与多数细菌性疾病有显著不同，宿主反应具有特殊意义，反应分为4期：1.起始期，入侵呼吸道的结核菌被肺泡巨噬细胞吞噬。因菌量、毒力和巨噬细胞非特异性杀菌能力的不同，被吞噬结核菌的命运各异。2.T细胞反应期，由T细胞介导的细胞免疫（CMI）和迟发性过敏反应（DTH）在此期形成，从而对结核病发病、演变及转归产生决定性影响。3.共生期，大部分感染者结核菌可以持续存活，细菌与宿主处于共生状态。纤维包裹的坏死灶干酪样中央部位被认为是结核杆菌持续存在的主要场所。低氧、低PH和抑制性脂肪酸的存在使细菌不能增殖。宿主的免疫机制亦是抑制细菌增殖的重要因素，倘若免疫损害便可引起受抑制结核菌的重新活动和增殖。4.细胞外增殖和传播期，固体干酪灶中包含具有生长能力、但不繁殖的结核菌。干酪灶一旦液化便给细菌增殖提供了理想环境。即使免疫功能健全的宿主，从液化干酪灶释放的大量结核杆菌亦足以突破局部免疫防御机制，引起播散。

结核病的全身症状是全身乏力、午后低热、盗汗、食欲不振、消瘦等；呼吸道症状是咳嗽、咳痰、咯血、胸疼、呼吸困难等。其特征性病理改变是肉芽肿病变和结核性结节，其基本病理变化为渗出性病变、增生性病变和坏死性病变。渗出性病变以炎症细胞、单核细胞肌纤维蛋白为主要成分，增殖性改变以结核结节及结合性肉芽肿为主，坏死的特征性改变为干酪样改变。结核性炎症的主要特是上皮样细胞结节及郎格汉斯细胞。实验室痰培养为菌阳性，抗酸染色可见细长略弯曲的杆菌，血沉加快。肺的原发病灶、淋巴管炎和肺门淋巴结结核合称为原发综合症，X线影像学上的典型表现为哑铃状阴影。感染3-8周后结核菌素皮试转阳，95%的健康感染者原发综合征自然消退，成为潜伏感染人群，约5%在日后因潜在感染复燃而发病,结核病起病缓慢，病程较长。

二、模型背景

1、外源铁及菌株信息

铁过载模型的外源铁为右旋糖酐铁注射液（江西创导动物保健品有限公司）；结核分支杆菌标准株 H37Rv（菌号 97 为 93009，本室保存）

2、实验动物背景信息

6~8 周龄 SPF 级雌性 C57BL/6N 小鼠

3、研究背景

铁是人体必需的微量元素之一，广泛分布在全身各种组织器官，对维持人体的各种生理功能和新陈代谢起重要作用。电子传递、细胞呼吸、细胞增殖与分化等过程中均需要铁的参与[1]。同时，铁也是病原体毒力和生长的必需微量营养素。临床 研 究 发现 机 体 “铁 负 荷 过载 ” (Ironoverload) 与结 核 分 枝杆 菌(Mycobacteriumtuberculosis, Mtb)感染宿主后结核病(Tuberculosis, TB)的发生发展密切相关。一方面，机体铁过载为胞内 Mtb 生长繁殖和毒力维持提供充足铁源，促进体内 Mtb 增殖，加速活动性 TB 患者疾病进程。TB-HIV 共感染者中， 高血浆铁蛋白 TB-HIV 共感染者死亡风险是前者的 3 倍。对比活动性 TB 患者、 非活动性 TB 患者以及健康人群血清 Fe 相关水平发现，TB 的活动性与血清 Fe 水平存在显著的负相关。另一方面，铁过载通过诱导羟基自由基产生，激活巨噬细胞氧化应激或凋亡信号通路并下调 TB 患者抗 Mtb 防御型 Th1 反应，削弱机体抗 Mtb 保护性免疫应答从而重新激活休眠的 Mtb，促使潜伏性结核感染的复燃。

尽管铁过载对机体抗结核免疫应答损伤得到了部分阐明，但铁过载如何促进巨噬细胞内 Mtb 的生长及其在 TB 的发生发展机制尚需进一步探讨。基于此，铁过载与抗结核感染得到了学者们的日益关注。由于临床患者个体差异大，取材受限，难以深入研究铁过载与 TB 之间的关系。本研究拟在利用外源性铁过载动物模型模拟临床情况，建立铁过载结核感染小鼠模型并分析铁代谢及 Mtb 相关指标，为后续铁过载与 TB 发病机制研究提供实验模型。

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