Epha4敲除大鼠模型

更新时间：2024-11-29 来源：健明迪检测

健明迪检测提供的Epha4敲除大鼠模型，讨论与结论 Epha4是最近发现的肌萎缩侧索硬化（渐冻症，ALS）的致病基因，目前关于Epha4的研究主要集中在其神经系统的发育阶段中所扮演的角色，具有CMA，CNAS认证资质。

讨论与结论

Epha4是最近发现的肌萎缩侧索硬化（渐冻症，ALS）的致病基因，目前关于Epha4的研究主要集中在其神经系统的发育阶段中所扮演的角色。然而，Epha4在不同组织器官中均广泛表达，而关于Epha4在其他组织中的作用却鲜有报道。

目前Epha4基因敲除动物模型多为小鼠。研究报道基因敲除的小鼠具有共济失调、袋鼠步态等表型。而我们建立的Epha4基因敲除大鼠除观察到以上表型外，还发现其生存率下降。且该模型因为在Epha4基因的启动子后插入了报告基因mCherry，可以观察到Epha4基因在不同组织器官的表达模式。该模型大鼠为探究Epha4在各组织器官中的病理生理作用提供了实验条件。

由于观察到Epha4基因在心脏中的差异性表达——在心脏中的分布主要集中在心房部位，所以我们推测Epha4基因对心房的结构功能产生影响。我们进一步检测了心脏功能，并发现心脏功能，尤其是心房功能出现明显改变。我们观察到Epha4基因敲除大鼠心房明显扩大，心房射血分数显著下降，且心电出现明显异常。所以Epha4可能对心房发育过程产生影响。因此，本基因敲除大鼠模型也可作为研究心房发育或心电异常的动物模型，为探究Epha4在心房发育及心电传导中的作用提供实验条件。

评价验证

4.1 Epha4敲除大鼠模型的建立

通过PCR方法进行基因型鉴定Epha4敲除大鼠基因型。免疫印迹Westernblot方法鉴定Epha4-/-大鼠epha4蛋白的敲除（图2）。

图2 Epha4敲除大鼠模型基因型鉴定及基因蛋白表达水平鉴定

4.2 Epha4敲除大鼠生存率分析

对Epha4-/-基因型和WT野生型进行生存率分析显示，WT生存正常，生存率为100%，Epha4-/-生存率下降（图3）。

图3 Epha4敲除大鼠生存率分析

4.3 Epha4敲除大鼠心脏重量/体重比分析

对WT和Epha4-/-进行大体形态观察并计算心脏重量与体重之比（heart weight/body weight，HW/BW）。实验结果，与野生型相比，2、6、9月龄Epha4-/-大鼠心脏/体重比均无明显变化（图4）。2M WT大鼠HW/BW平均值±标准差为0.38 ± 0.035（%），KO大鼠0.393 ± 0.052（%）；6M WT大鼠HW/BW平均值±标准差为0.352 ± 0.024（%），KO大鼠0.0.369 ± 0.035（%）；9M WT大鼠HW/BW平均值±标准差为0.311 ± 0.043（%），KO大鼠0.338± 0.047（%）。从形态观察发现，Epha-/-大鼠的心房与野生大鼠相比明显增大，计算心房重量与心脏重量比值（atrium weight/body weight,AW/HW）。实验结果显示，与WT相比，Epha4-/-右心房/心脏重量比显著增加，2M WT大鼠右心房AW/HW平均值±标准差为5.939 ± 1.192（%），KO大鼠为7.112 ± 1.283（%）；6M WT大鼠右心房AW/HW平均值±标准差为4.655 ± 0.541（%），KO大鼠为6.892 ± 0.857（%），有显著性差异（图5，*P<0.05）；9M WT大鼠右心房AW/HW平均值±标准差为4.72± 0.936（%），KO大鼠为7.478± 0.681（%），差异非常显著（图5，**P<0.01）。
图 4 Epha4敲除大鼠HW/BW比率分析
图 5 Epha4敲除大鼠AW/HW比率分析
4.4 M型超声心动图检测Epha4敲除大鼠心脏的结构和功能
为分析心脏结构与功能状态改变，本研究通过M型超声心动图检测1、2、6、9四个月龄野生和敲除大鼠心脏的结构和功能。发现与同窝WT大鼠相比，自2M起，Epha4-/-大鼠射血分数明显下降，差异显著（图6，*P<0.05，**P<0.01），而左心室内径、室壁均无明显变化（图6）。
图6 Epha4敲除大鼠左心室结构功能分析
注：射血分数（ejection fraction，EF）；舒张期左心室前壁厚度（left ventricular anterior wall; diastolic，LVAW;d）；左心室舒张末期内径（left ventricular end-diastolic diameter，LVID;d）；、。*P<0.05，**P<0.01，versus同窝WT大鼠。
4.5磁共振成像分析Epha4敲除大鼠心房结构和功能
为进一步分析Epha4敲除大鼠心房的结构和功能，本研究通过核磁分析2、6、9月龄WT和Epha4敲除大鼠左右心房容积和射血分数。结果表明，与WT大鼠相比，Epha4敲除大鼠左右心房容积均无明显变化。但6、9月龄敲除大鼠心房射血分数与野生大鼠相比明显下降，6M组WT左房射血分数为69.763±9.918（%），KO左房射血分数为47.35±7.458（%）；WT右房射血分数为69.123±14.592（%），KO右房射血分数为39.67±7.653（%）。9M组WT左房射血分数为52.738±10.739（%），KO左房射血分数为46.637±4.487（%）；WT右房射血分数为56.978±14.281（%），KO右房射血分数为32.967±2.492（%）（图7）。
图 7 Epha4敲除大鼠左右心房结构功能分析
4.6心电分析Epha4敲除大鼠心传导功能
从上面的结果我们已知，心房的改变发生在心室改变之前，为了进一步分析心房的电传导功能，我们对WT和Epha4敲除大鼠进行了心电图记录。结果显示，自1M起，敲除大鼠的心电出现了明显的改变，p波消失（图8），QRS波峰值增高，QT间期延长（图9，**P<0.01）。
图 8 Epha4敲除大鼠心电图记录
图 9 Epha4敲除大鼠心电指标分析

制备方法

3.1 实验材料

3.1.1 实验动物

SD大鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司【SCXK（京）2012-001】。实验中涉及动物的操作程序已获得中国医学科学院医学实验动物研究所实验动物使用与管理委员会的批准，批准号为ZLF18003.

3.1.2实验仪器

3.1.3实验试剂

3.1.4 模型构建流程在Epha4基因的启动子后插入一个报告基因mCherry，造成移码突变，实现基因敲除，制备Epha4基因敲除大鼠，并使用PCR方法进行基因型鉴定，使用Western blot技术进行敲除效率的鉴定。3.1.5 Epha4敲除大鼠的建立3.1.5. 1 Epha4敲除大鼠模型的建立(1) 设计方案

(2) 构建sgRNA 载体pUC57-sgRNA expressionvector，根据基因信息选择靶点并合成sgRNA。

靶点1:

CCA GCCTCCGGAGACCTTGAG

R-EPHA4-gRNAUP1 5’TAGGCTCAAGGTCTCCGGAGGC

R-EPHA4-gRNADOWN1 5’AAACGCCTCCGGAGACCTTGAG

靶点2:

CCC GGCGAATGAAGGTAAGAG

R-EPHA4-gRNAUP2 5’TAGGCTCTTACCTTCATTCGCC

R-EPHA4-gRNADOWN2 5’AAACGGCGAATGAAGGTAAGAG

(3) 合成的sgRNA单链通过退火复性结合成小片段，插入BSA I线性化的载体，构建完成的sgRNA载体通过体外转录成为可注射的sgRNA。

(4) 构建Cas9载体pST1374-NLS-flag-linker-Cas9，载体通过体外转录成为可注射的Cas9-RNA。

(5) 显微注射

1) 超数排卵：15只3-4周龄SD雌鼠注射激素进行超排。

2) 受精卵注射：取约150枚受精卵进行注射。

3) 雄鼠结扎：制作30只8周龄输精管结扎的SD雄鼠。

4) 受体鼠制备：8-10周龄SD雌鼠与结扎的SD雄鼠交配后选取见栓的雌鼠。

5) 胚胎移植：将注射后的受精卵移植到受体鼠输卵管壶腹部（移植一次，150枚卵，5只受体鼠）。

(6) 基因型鉴定

1) 剪尾编号：出生7-10天的乳鼠，剪取脚趾和尾尖进行编号及取材。

2) 基因组DNA提取：使用基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA

3) PCR检测：根据序列信息设计检测引物并进行PCR检测。

(7) 结果分析：选取通过PCR检测后含有不同于野生型分子量条带的鼠号，将PCR产物进行TA克隆，之后用检测引物进行菌液PCR，筛选有插入的克隆测序。

(8) 根据测序结果确定Epha4敲除模型大鼠（SD.Epha4(tm-mCherry)-GC/ILAS，http://www.ratresource.com）用于后续实验。

3.1.5.2 Epha4敲除大鼠的建立

根据3.1.5.1获得Epha4-/-大鼠F1代后，首先通过8周龄左右Epha4-/-与野生型大鼠进行杂交，获得一定数量的Epha4+/-大鼠。之后使8周龄左右Epha4+/-大鼠进行第二轮杂交，可得到Epha4-/-大鼠，用于后续实验。

3.1.5.3 鼠尾基因组DNA提取

在幼崽出生后剪脚趾标记，收集幼崽脚趾至1.5 mL EP管。然后参照DNA提取试剂盒说明书按以下程序操作。

(1) 加入100μL LB2和20 μL Proteinase K，55℃摇床孵育至完全裂解。

(2) 12000rpm 离心5min，转移上清于一无菌的离心管中。

(3) 加入500μLBB2，立即涡旋5s，室温孵育10min。

(4) 将全部的溶液加入离心柱中，8000rpm离心1min，弃掉流出液。

(5) 加入500μL CB2溶液，12000 rpm离心1min，弃掉流出液。

(6) 重复步骤（5）一次。

(7) 加入500μL WB2（使用前加入88 mL无水乙醇），12000rpm 离心1min，弃掉流出液。

(8) 重复步骤（7）一次。

(9) 10000rpm 离心2min，彻底去除残留的WB2。

(10) 将离心柱置于一干净的离心管中，开盖静置5min，在柱的中央加入50~200μL预热EB（60℃~70℃），盖上盖子，室温静置3min，12000rpm 离心2min，洗脱DNA。保存至4℃冰箱。

研究背景

一、疾病概述

心律失常（arrhythmia）是由于窦房结激动异常或激动产生于窦房结以外，激动的传导缓慢、阻滞或经异常通道传导，即心脏活动的起源和（或）传导障碍导致心脏搏动的频率和（或）节律异常。心律失常是心血管疾病中重要的一组疾病。它可单独发病，亦可与其他心血管病伴发。其预后与心律失常的病因、诱因、演变趋势、是否导致严重血流动力障碍有关，可突然发作而致猝死，亦可持续累及心脏而致其衰竭。

遗传性心律失常多为基因通道突变所致，如长QT综合征、短QT综合征、Brugada综合征等。后天获得性心律失常可见于各种器质性心脏病，其中以冠状动脉粥样硬化性心脏病、心肌病、心肌炎和风湿性心脏病多见，尤其在发生心力衰竭或急性心肌梗死时。另有发生在基本健康者或植物神经功能失调患者中的心律失常。其他病因包括电解质或内分泌失调，麻醉，低温，胸腔或心脏手术，药物作用和中枢神经系统疾病等，部分病因不明。

二、模型背景

1、造模因素信息

Epha4，Ephreceptor A4 [Rattus norvegicus]，Gene ID：316539。

2、实验动物背景信息

SD大鼠

3、研究背景

受体酪氨酸激酶（receptortyrosine kinases, RTKs）可使外界刺激信息传递至细胞核，参与细胞生长、增殖、转化及胚胎发育等重要生理过程。Eph家族(包括Eph受体和ephrin配体)是最大的RTK亚族。Eph受体是一种膜结合的Ⅰ型糖蛋白,其结构分为胞外区、胞内区及跨膜区，其胞外区包括一个IgG样球形结构域。作为一大类新发现的RTK，Eph家族广泛的种属和组织分布，结构上的高度保守，提示它们在细胞内具有重要的生理功能。研究发现，Eph家族不仅在胚胎神经、脉管系统的发育和分化中发挥作用，而且参与不同组织和细胞间多条通路的信号转导以及免疫功能的调节；另外，其与肿瘤的发生发展等过程也密切相关1,2。有关Eph的研究尚处于资料和认识的积累阶段；克隆Eph亚族新基因，继续探索各成员的天然配体、特异底物范围及生理功能仍然是目前研究的热点。

根据基因结构、碱基序列同源性、表达分布及结合配体的不同，Eph受体被分为EphA（A1-A8，A10）和EphB（B1-B4，B6）两个亚家族，其相应配体被命名为ephrin，根据结合方式也分为Ａ、Ｂ两类ephrinA（A1-A5）与ephrinB（B1-B3）3,4。一般认为EphA的配体是ephrinA，EphB的配体是ephrinB，但是研究发现Epha4既可以结合ephrinA也可结合ephrinB5。

Epha4与配体结合后，可以激活其下游NCK、RAS、Src、PDZ等信号，参与细胞生长、运动、凋亡及癌变等重要生理病理过程6-9。目前关于Epha4的研究主要集中在中枢神经系统的发育过程。在发育早期，Epha4在中枢神经的发育过程中高表达，与菱脑发育和形态形成关系密切；在成年阶段，Epha4被证实与突触可塑性和兴奋毒性有关，同时它还是肌萎缩侧索硬化症（amyotrophiclateral sclerosis，ALS）的重要修饰基因3,10, 11。然而，Epha4的表达不仅限于神经系统；根据表达谱，在人体多种组织中，Epha4均有不同程度表达。最新研究表明，Epha4与多发性骨髓瘤、结肠癌、前列腺癌、胃癌、乳腺癌、胰腺导管癌等多种肿瘤的发生、转移、预后等过程有关12-19；另外，Epha4还参与胰高血糖素分泌、破骨细胞活性调控、单核细胞在血管上皮粘附、先天性肾盂积水以及胸腺发育等生理或病理过程20-23（表1），预示着Epha4在非神经组织中也应具有重要作用。

目前的研究多采用基因敲除小鼠作为Epha4基因功能研究的动物模型。研究发现，基因敲除小鼠表现出中枢神经系统发育异常、跳跃的“袋鼠式”步态，同时还出现肾组织损伤、胸腺发育异常等20,21, 24, 25。但关于Epha4对其他非神经组织的影响未见报道。

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