Isca1心肌特异性基因敲除SD大鼠模型

Isca1是最近发现的多发性线粒体功能障碍综合征（MMDS）的致病基因，目前已有研究发现Isca1在线粒体以及胞质铁硫簇生物合成过程中起重要作用，而铁硫簇最重要的生物学功能是作为电子传递蛋白的辅助基团参与能量转移。

所以推测Isca1基因对机体线粒体功能及能量代谢进程具有重要作用，而心脏作为机体内重要高耗能脏器，Isca1基因对心脏发育，能量代谢及病理进程可能具有重要作用。

然而，目前还没有该基因心肌特异性敲除大鼠模型的建立及研究报道，所以特构建该模型大鼠，以分析Isca1基因对心脏发育的影响及其生物学功能，为新的心肌能量代谢异常和由心肌线粒体功能障碍导致的心衰大鼠模型的建立提供实验依据。

已构建成功的心肌特异性敲除纯合子大鼠模型，出生后7-10天即陆续死亡，至出生后11天生存率为0%，至6.5天时小鼠心脏整体扩张严重，心功能下降显著，表现为严重心衰症状，心肌纤维断裂溶解，心肌线粒体肿胀，嵴消失，空化严重。推测该模型大鼠由Isca1基因缺失后导致线粒体功能障碍，进而引发心衰及死亡。

该模型对于Isca1基因的生物学功能研究，特别是其对心肌线粒体功能的影响及机制分析提供了工具动物，并且可成为由心肌线粒体功能障碍导致心衰的工具动物模型。但是该动物模型发病较早，限制了部分实验的实施和后续研究。

SD大鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司【SCXK（京）2012-001】。实验中涉及动物的操作程序已获得中国医学科学院医学实验动物研究所实验动物使用与管理委员会的批准，批准号为ZLF18003.

4.1 心肌组织特异性Isca1敲除大鼠模型的建立

利用Cre/loxP重组系统的原理，进行条件性敲除（Conditionalknockout，CKO），制备心肌组织特异性Isca1敲除大鼠。在Isca1基因第三外显子两端插入两个loxP位点来构建Isca1flox/+大鼠，使其与αMHC-Cre大鼠进行杂交，经两轮杂交最终获得Isca1flox/flox/MHC-Cre大鼠，通过PCR方法进行基因型鉴定心肌组织特异性Isca1敲除大鼠基因型。免疫印迹Westernblot方法鉴定Isca1flox/flox/MHC-Cre大鼠ISCA1蛋白的敲除效率达90%以上（图3）。

图3 心肌组织特异性Isca1敲除大鼠模型基因型鉴定及基因蛋白表达水平鉴定

4.2 心肌组织特异性Isca1敲除大鼠生存率分析

为观察心肌组织特异性Isca1敲除大鼠子代基因型及生存率情况，将 Isca1flox/+大鼠与MHC-Cre大鼠经两代杂交，得到野生型（WT）、心肌特异性Isca1敲除大鼠杂合子（Isca1flox/+/MHC-Cre）和心肌特异性Isca1敲除大鼠纯合子（Isca1flox/flox/MHC-Cre）幼崽，根据孟德尔定律，上述基因型比例应为5：2：1，实验结果显示，累积统计幼崽共127只，其中WT幼崽74只，Isca1flox/+/MHC-Cre 幼崽37只，Isca1flox/flox/MHC-Cre幼崽16只，经计算可得子代中野生型、杂合子型、纯合子型三种基因型幼崽出生比例基本符合孟德尔定律（图4）。对三种基因型子代进行生存率分析显示，子代中WT和Isca1flox/+/MHC-Cre幼崽生存正常，生存率为100%，Isca1flox/flox/MHC-Cre幼崽7~10天全部死亡，至11天生存率为0%（图4）。

图4 心肌组织特异性Isca1敲除大鼠生存率分析

注：（A）Isca1flox/+大鼠与Isca1flox/+/MHC-Cre大鼠杂交后，出生子代基因型情况统计。（B）Isca1flox/+大鼠与Isca1flox/+/MHC-Cre大鼠杂交后，WT和Isca1flox/flox/MHC-Cre子代生存率统计。

4.3 心肌组织特异性Isca1敲除大鼠心脏重量/体重比分析

使 Isca1flox/+大鼠与Isca1flox/+/MHC-Cre大鼠杂交，于子代出生后6.5天对WT和Isca1flox/flox/MHC-Cre（CKO）子代进行大体形态观察并计算心脏重量与体重之比（heartweight/body weight，HW/BW）。实验结果，与野生型相比，6.5 d CKO大鼠呼吸虚弱，处于濒临死亡状态（图5），并且心脏外观出现明显肥大。6.5d CKO大鼠HW/BW平均值±标准差为（8.11± 1.85）mg/g，较6.5d WT大鼠（平均值±标准差为（6.50± 1.01） mg/g）显著增加，有显著性差异（图5，*P<0.05）。

图 5 心肌组织特异性Isca1敲除大鼠HW/BW比率分析

4.4 M型超声心动图检测6.5 d心肌特异性Isca1敲除大鼠心脏的结构和功能

为分析心脏结构与功能状态改变，本研究通过M型超声心动图检测6.5d 野生和心肌组织特异性敲除大鼠心脏的结构和功能。发现与同窝WT大鼠相比，6.5dKO大鼠射血分数大幅下降，左心室内径明显增大，伴随室壁变薄，表现为收缩无力，心室严重扩张，已出现心功能下降、严重心衰的症状。

表1. 6.5 d心肌组织特异性Isca1敲除大鼠心脏M型超声影像参数分析

注：左心室舒张末期内径（leftventricular end-diastolic diameter，LVID;d）；左心室收缩末期内径（left ventricular end-systolic diameter，LVID;s）；射血分数（ejection fraction，EF）；短轴缩短率（fractional shortening，FS）；舒张期左心室后壁厚度（left ventricular posterior wall; diastolic，LVPW;d）；收缩期左心室后壁厚度（left ventricular posterior wall; systolic，LVPW;s）；舒张期左心室前壁厚度（left ventricular anterior wall; diastolic，LVAW;d）；收缩期左心室前壁厚度（left ventricular anterior wall; systolic，LVAW;s）。*P<0.05，**P<0.01，versus同窝WT大鼠。

4.5 心肌组织特异性Isca1敲除大鼠心肌纤维及线粒体形态观察

为进一步分析心肌组织特异性Isca1敲除大鼠心肌纤维和线粒体形态改变，取6.5天WT和心肌组织特异性Isca1敲除大鼠，摘取心脏，取左心室2mm×2 mm大小新鲜组织，使用电镜专用固定液进行固定，制备电镜样本并进行观察。结果显示，WT大鼠心肌纤维排列整齐，肌节和Z线清晰，心肌内线粒体多呈圆形或椭圆形，线粒体双层膜膜结构清晰，嵴致密。而6.5天心肌组织特异性Isca1大鼠敲除心肌纤维出现断裂，肌节和Z线严重模糊，部分位置纤维已溶解，心肌内线粒体膜结构受损，线粒体内嵴结构消失，线粒体肿胀及空化严重（图6）。

图6心肌组织特异性Isca1敲除大鼠超微结构形态观察

3.1 实验材料

3.1.1 实验动物

SD大鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司【SCXK（京）2012-001】。实验中涉及动物的操作程序已获得中国医学科学院医学实验动物研究所实验动物使用与管理委员会的批准，批准号为ZLF18003.

3.1.2实验仪器

3.1.3实验试剂

3.1.4 模型构建流程 利用Cre/loxP重组系统的原理，进行条件性敲除（Conditional knockout，CKO），制备心肌组织特异性Isca1敲除大鼠。在Isca1基因第三外显子两端插入两个loxP位点来构建Isca1flox/+大鼠，使其与αMHC-Cre大鼠进行杂交，经两轮杂交最终获得Isca1flox/flox/MHC-Cre大鼠，并使用PCR方法进行基因型鉴定，使用Western blot技术进行敲除效率的鉴定。3.1.5 Isca1条件性敲除大鼠及心肌组织特异性Isca1敲除大鼠的建立3.1.5.1 Isca1条件性敲除大鼠模型的建立

图 1. Isca1条件性敲除模型构建设计方案

(2) 构建sgRNA 载体pUC57-sgRNA expressionvector，根据基因信息选择靶点并合成sgRNA。

靶点1:

GCCTCCTGAGCAAGTGCT GGG

R-ISCA1-gRNAUP1 5’TAGGGCCTCCTGAGCAAGTGCT

R-ISCA1-gRNADOWN1 5’AAACAGCACTTGCTCAGGAGGC

靶点2:

AGCCCTGAACTCCTTATG TGG

R-ISCA1-gRNAUP2 5’TAGGAGCCCTGAACTCCTTATG

R-ISCA1-gRNADOWN2 5’AAACCATAAGGAGTTCAGGGCT

(3) 合成的sgRNA单链通过退火复性结合成小片段，插入BSA I线性化的载体，构建完成的sgRNA载体通过体外转录成为可注射的sgRNA。

(4) 构建Cas9载体pST1374-NLS-flag-linker-Cas9，载体通过体外转录成为可注射的Cas9-RNA。

(5) 显微注射

1) 超数排卵：15只3-4周龄SD雌鼠注射激素进行超排。

2) 受精卵注射：取约150枚受精卵进行注射。

3) 雄鼠结扎：制作30只8周龄输精管结扎的SD雄鼠。

4) 受体鼠制备：8-10周龄SD雌鼠与结扎的SD雄鼠交配后选取见栓的雌鼠。

5) 胚胎移植：将注射后的受精卵移植到受体鼠输卵管壶腹部（移植一次，150枚卵，5只受体鼠）。

(6) 基因型鉴定

1) 剪尾编号：出生7-10天的乳鼠，剪取脚趾和尾尖进行编号及取材。

2) 基因组DNA提取：使用基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA

3) PCR检测：根据序列信息设计检测引物并进行PCR检测。

(7) 结果分析：选取通过PCR检测后含有不同于野生型分子量条带的鼠号，将PCR产物进行TA克隆，之后用检测引物进行菌液PCR，筛选有插入的克隆测序。

(8) 根据测序结果确定Isca1条件性敲除模型大鼠（SD. Isca1 (tm-loxp)-GC/ILAS，http://www.ratresource.com）用于后续实验。

3.1.5.2 心肌组织特异性Isca1敲除大鼠（Isca1flox/flox/MHC-Cre）的建立

根据3.1.5.1获得Isca1flox/+大鼠F1代后，首先通过8周龄左右Isca1flox/+与野生型大鼠进行杂交，获得一定数量的Isca1flox/+大鼠。与此同时使8周龄左右Isca1flox/+大鼠与αMHC-Cre大鼠（SD.Tg(MHC-CRE)-GC/ILAS，http://www.ratresource.com）进行杂交，得到Isca1flox/+/MHC-Cre大鼠。之后使8周龄左右Isca1flox/+大鼠与Isca1flox/+/MHC-Cre大鼠进行第二轮杂交，可得到Isca1flox/flox/MHC-Cre大鼠，即心肌组织特异性Isca1敲除纯合子大鼠，用于后续实验。

图2.Isca1flox/flox/MHC-Cre大鼠的繁育

3.1.5.3 鼠尾基因组DNA提取

在幼崽出生后剪脚趾标记，收集幼崽脚趾至1.5 mL EP管。然后参照DNA提取试剂盒说明书按以下程序操作。

(1) 加入100μL LB2和20 μL Proteinase K，55℃摇床孵育至完全裂解。

(2) 12000rpm 离心5min，转移上清于一无菌的离心管中。

(3) 加入500μLBB2，立即涡旋5s，室温孵育10min。

(4) 将全部的溶液加入离心柱中，8000rpm离心1min，弃掉流出液。

(5) 加入500μL CB2溶液，12000 rpm离心1min，弃掉流出液。

(6) 重复步骤（5）一次。

(7) 加入500μL WB2（使用前加入88 mL无水乙醇），12000rpm 离心1min，弃掉流出液。

(8) 重复步骤（7）一次。

(9) 10000rpm 离心2min，彻底去除残留的WB2。

(10) 将离心柱置于一干净的离心管中，开盖静置5min，在柱的中央加入50~200μL预热EB（60℃~70℃），盖上盖子，室温静置3min，12000rpm 离心2min，洗脱DNA。保存至4℃冰箱。

一、疾病概述

心力衰竭，简称心衰，是指由于心脏收缩和（或）舒张功能障碍，无法将静脉回心血量充分排出心脏，导致静脉系统血液淤积，动脉系统灌注不足，从而引发心脏循环障碍症候群，心衰并不是一个独立的疾病，而是所有心血管疾病发展的终末阶段。

近年来，随着我国社会老龄化和高血压，冠心病等心血管疾病发病率的增加，使得心衰呈现高发病率，高致残率和高死亡率的特点，《2018中国心力衰竭诊断和治疗指南》中报道我国心衰患病率为0.9%，有1000万左右的心衰患者。

几乎所有的心血管疾病最终都会导致心衰的发生，而在基础性心脏病的基础上，一些因素亦可诱发心衰的发生，常见诱因包括，感染，严重心律失常，心脏负荷增大，药物中毒（如洋地黄）等等。

心衰在临床上可分为急性心衰和慢性心衰。临床表现，包括呼吸困难，运动耐力下降，心室腔增大，心脏功能下降（LVEF<40-50%），心脏顺应性降低，心室腔内淤血，肺循环及体循环淤血。

临床检查手段，包括超声影像分析，心电图，心衰标志物（B型利钠肽（BNP），N末端B型利钠肽原（NT-proBNP））心肌坏死标志物（心肌肌钙蛋白T（cTnT）及心肌肌钙蛋白I（cTnI））。

临床治疗方法，包括强心（米力农，地高辛），利尿（速尿），抗感染，改善心肌重构（卡维地洛）及心脏移植。

二、模型背景

1、xx（细胞/基因/病原/其他造模因素）信息

2、实验动物背景信息

SD大鼠

3、研究背景

Isca1是最近发现的多发性线粒体功能障碍综合征（MMDS）的致病基因，目前已有研究发现Isca1在线粒体以及胞质铁硫簇生物合成过程中起重要作用，而铁硫簇最重要的生物学功能是作为电子传递蛋白的辅助基团参与能量转移【1-6】。

所以推测Isca1基因对机体线粒体功能及能量代谢进程具有重要作用，而心脏作为机体内重要高耗能脏器，Isca1基因对心脏发育，能量代谢及病理进程可能具有重要作用。

目前还没有该基因心肌特异性敲除大鼠模型的建立及研究报道，所以特构建该模型大鼠，以分析Isca1基因对心脏发育的影响及其生物学功能，为新的心肌能量代谢异常和由心肌线粒体功能障碍导致的心衰大鼠模型的建立提供实验依据。

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