C9ORF72基因敲除大鼠模型

已有4篇C9orf72 BACs转基因小鼠模型的报道，均产生RNA灶和DPRs但其中2例未出现ALS/FTD的神经退行性或行为特征。其中只有一个表现出FTD的特征，另一个表现出与ALS和FTD相似的运动缺陷和神经变性。这些来自哺乳动物研究的数据提出了一个问题，即产生RNA灶和DPRs的C9orf72六核苷酸重复扩增是否足以用于疾病的发病机制。在人类患者，G4C2六核苷酸重复扩增显著抑制C9orf72蛋白表达，C9orf72基因的敲除导致斑马鱼运动障碍，说明C9orf72单倍体功能不全以及RNA foci和/或DPRs的存在也可能是ALS发病的危险因素。

我们的结果表明，在KA的存在下，KO大鼠出现进行性运动功能障碍与运动神经元的丢失。提示C9orf72敲除大鼠需要额外的兴奋性毒性的刺激来诱发ALS。肌萎缩性脊髓侧索硬化症(ALS)的大多数病例中都发现了由兴奋性引起的运动神经元兴奋毒性的改变。作为一种可能的肌萎缩性脊髓侧索硬化症的常见介质，它可以与其他遗传因子相互作用，触发疾病的发病机制。我们的研究结果表明，C9orf72功能的丧失和兴奋性毒性是诱发ALS发病的重要因素。这些结果提示C9orf72单倍体功能不全可能是人类发病机制的一部分。

C9orf72蛋白能够与Rab家族的GTPases、RAB7L1、Rab1a、Rab5、Rab8和Rab39、cofilin和SMCR8等多种蛋白相互作用，并活跃于自噬、细胞膜转运、囊泡转运和溶酶体生物发生。在散发性和家族性肌萎缩性脊髓硬化(ALS)中，高尔基体破碎和核内体异常是神经元细胞体和轴突退行性消失之前的常见病理变化。最近，有报道称C9orf72单核细胞功能不全破坏了C9orf72 ALS/FTD患者的囊泡转运和溶酶体生物发生。我们的研究结果还显示，KA处理后C9orf72-/-大鼠腰脊髓组织的运动神经元中，早期内泌体、溶酶体和再循环内泌体的高尔基体复合物严重破碎和分散。C9orf72敲除或KA单独刺激仅引起轻度高尔基体复杂碎片化和囊泡弥散。这一结果提示C9orf72敲除运动神经元可能导致高尔基体的复杂性、易碎性和对其他应力的易感性。RNA测序分析显示，C9orf72敲除对神经活动相关的基因表达谱产生严重干扰，包括神经发生、周围神经分化、细胞死亡、神经元投射、囊泡运输和神经肌肉过程。

综上所述，我们的数据显示C9orf72敲除单独不足以引起ALS发病机制，但它使运动神经元对其他危险因素如兴奋性毒性敏感，在体内协同作用导致ALS。我们的研究结果也提示C9orf72单倍体功能不全可能是ALS发病机制之一，提高运动神经元中C9orf72水平可作为一种可能的治疗策略进行检测。

SD大鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司【SCXK（京）2012-001】。实验中涉及动物的操作程序已获得中国医学科学院医学实验动物研究所实验动物使用与管理委员会的批准，批准号为ZLF18003. 本实验部分使用了基因修饰动物（基因敲除），如果动物逃逸，将会造成的环境潜在的基因污染。实验动物饲养繁殖于屏障环境中，整个实验过程中保证动物处于监管状态，无逃脱可能。动物房出入口安放挡鼠板，严防动物逃逸，动物笼具一经发现破损，立即更换，饲养人员出入确保动物房门关紧并锁住等。含重组DNA的废弃核酸样品、离心管、枪头等用 1M NaOH溶液浸泡后，装入密封袋中，统一送到化学废弃物处理公司处理。

1，C9ORF72基因敲除大鼠的建立

2，C9ORF72基因敲除和兴奋毒性共同诱导运动缺陷

3，C9ORF72基因敲除和兴奋毒性联合作用导致运动神经元丢失

4，C9ORF72基因敲除大鼠脊髓免疫荧光染色分析

5，兴奋毒性诱导与不诱导的WT和C9orf72敲除大鼠脊髓细胞RNA测序分析

3.1 实验材料

3.1.1 实验动物

SD大鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司【SCXK（京）2012-001】。实验中涉及动物的操作程序已获得中国医学科学院医学实验动物研究所实验动物使用与管理委员会的批准，批准号为ZLF18003.

3.1.2实验仪器

3.1.3实验试剂

3.1.4模型构建流程

(1) 设计方案

(2) 构建sgRNA 载体pUC57-sgRNA expression vector，根据基因信息选择靶点并合成sgRNA。靶点1:ccc caccatctcctgctgttg靶点2:aacggagatcggagcactta cgg(3) 合成的sgRNA单链通过退火复性结合成小片段，插入BSA I线性化的载体，构建完成的sgRNA载体通过体外转录成为可注射的sgRNA。(4) 构建Cas9载体pST1374-NLS-flag-linker-Cas9，载体通过体外转录成为可注射的Cas9-RNA。(5) 显微注射 1) 超数排卵：15只3-4周龄SD雌鼠注射激素进行超排。 2) 受精卵注射：取约150枚受精卵进行注射。 3) 雄鼠结扎：制作30只8周龄输精管结扎的SD雄鼠。 4) 受体鼠制备：8-10周龄SD雌鼠与结扎的SD雄鼠交配后选取见栓的雌鼠。 5) 胚胎移植：将注射后的受精卵移植到受体鼠输卵管壶腹部（移植一次，150枚卵，5只受体鼠）。(6) 基因型鉴定 1) 剪尾编号：出生7-10天的乳鼠，剪取脚趾和尾尖进行编号及取材。 2) 基因组DNA提取：使用基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA 3) PCR检测：根据序列信息设计检测引物并进行PCR检测。(7) 结果分析：选取通过PCR检测后含有不同于野生型分子量条带的鼠号，将PCR产物进行TA克隆，之后用检测引物进行菌液PCR，筛选有插入的克隆测序。(8) 根据测序结果确定C9ORF72基因敲除模型大鼠（SD. C9ORF72 (tm)-GC/ILAS，http://www.ratresource.com）用于后续实验。

一、疾病概述

肌萎缩侧索硬化（ALS）也叫运动神经元病（MND），后一名称英国常用，法国又叫夏科（Charcot）病，而美国也称卢伽雷（Lou Gehrig）病。我国通常将肌萎缩侧索硬化和运动神经元病混用。它是上运动神经元和下运动神经元损伤之后，导致包括球部（所谓球部，就是指的是延髓支配的这部分肌肉）、四肢、躯干、胸部腹部的肌肉逐渐无力和萎缩。患病率约为4-6/10万。大约10%的ALS病例是家族型的，90%是散发型的。

2018年5月11日，国家卫生健康委员会等5部门联合制定了《第一批罕见病目录》，肌萎缩侧索硬化被收录其中。

病因

肌萎缩侧索硬化的病因至今不明。20%的病例可能与遗传及基因缺陷有关。另外有部分环境因素，如重金属铝中毒等，都可能造成运动神经元损害。产生运动神经元损害的原因，目前主要理论有：神经毒性物质累积，谷氨酸堆积在神经细胞之间，久而久之，造成神经细胞的损伤；自由基使神经细胞膜受损；神经生长因子缺乏，使神经细胞无法持续生长、发育。

临床症状

该病早期症状轻微，易与其他疾病混淆。患者可能只是感到有一些无力、肉跳、容易疲劳等一些症状，渐渐进展为全身肌肉萎缩和吞咽困难。最后产生呼吸衰竭。

依临床症状大致可分为两型：

1.肢体起病型

症状首先是四肢肌肉进行性萎缩、无力，最后才产生呼吸衰竭。

2.延髓起病型

先期出现吞咽、讲话困难，很快进展为呼吸衰

诊断

要早期诊断肌萎缩侧索硬化，除了神经科临床检查外，还需做肌电图、神经传导速度检测、血清特殊抗体检查、腰穿脑脊液检查、影像学检查，甚至肌肉活检。

1.病史采集和神经系统检查

诊断过程的第一个重要步骤，就是由神经科医生进行的临床接诊。进行包括详细的现病史，家庭史，工作和环境接触史的采集。接诊过程中，神经科医生将寻找肌萎缩侧索硬化的典型表现：

（1）检查要评估咀嚼和吞咽的肌肉力量，包括口腔、舌及咽喉肌。

（2）下运动神经元（LMN）功能，如肌肉萎缩情况，肌肉力量或肌肉跳动（称为肌束震颤）。

（3）上运动神经元（UMN）功能，如腱反射亢进和肌肉痉挛（肌肉紧张和僵直的程度）

（4）情绪反应失去控制，如哭或笑的情绪变化。思维的变化如丧失判断力或失去基本的社会技能。检查者也会评估患者言语流畅性及文字识别能力。这些症状不常见，不容易引起重视。

（5）神经科医生还将询问如疼痛，感觉丧失或锥体外系问题。

2.辅助检查

诊断过程的下一步往往是一系列的辅助检查，如颈部MRI（磁共振成像）、头和腰MRI，EMG（肌电图）、神经传导速度和血液化验。有时会做基因检测或腰椎穿刺。

（1）磁共振成像（MRI）是一种无痛、非侵入性的检查，能非常详细提供脊髓和环绕、保护脊髓的骨骼及结缔组织的结构。将有助于除外对脊髓或主要神经的压迫（如突出的椎间盘）、多发性硬化、骨肿瘤压迫神经等异常、脊髓或脑中风。

（2）肌电图（EMG）是诊断过程一个非常重要的部分。该检查有时不舒服，但有必要完成。第一部分通过小型电极在特定部位发送刺激经过所检测的神经，在另一部位接受信号。根据所需时间测定传导速度以判断是否有神经损伤。第二部分测试选定肌肉的电活动。通过很细的针插入到选定的肌肉，并用它来“听”这些肌肉的电活动模式。

（3）血液、尿液和其他检查验血是为了筛查其他疾病，有些疾病症状类似肌萎缩侧索硬化早期迹象。这些检查包括甲状腺或甲状旁腺疾病、维生素B12缺乏、艾滋病毒感染、肝炎、自身免疫性疾病以及某些类型的癌症。肌酸激酶（CK）是肌肉受伤或死亡释放的酶，也常检查。其他还包括自身免疫抗体、抗-GM1抗体检测，寻找可能与某些癌症有关的血液标志物。根据患者工作和环境，也可能做重金属检测。如果家庭里其他成员患肌萎缩侧索硬化应该做肌萎缩侧索硬化基因检测。有时可能需要腰穿。有些患者除无力外，有疼痛或肌酸磷酸激酶（CK）非常高的表现，可能需要肌肉活检。

3.诊断

这些检查完成后，有经验的神经科大夫就可以判断患者是否为肌萎缩侧索硬化。有时确诊所需要的症状和检查结果并非都异常（尤其是在疾病的最早阶段）。在这种情况下，神经科大夫会检查建议随诊，3个月后重复体检和肌电图。

二、模型背景

1、基因信息

C9ORF72基因,Gene ID: 313155。

2、实验动物背景信息

SD大鼠

3、研究背景

肌萎缩侧索硬化症（ALS）是一种累进性神经退行疾病，以控制肌肉收缩的上、下运动神经元选择性退化和凋亡为特征，引发瘫痪、最终导致死亡，患病率约为4-6/10万。大约10%的ALS病例是家族型的，90%是散发型的。从发现SOD1基因突变到现在，共确定了30余种致病基因，其中C9orf72，FUS，TARDBP，SOD1等比例较高，而EPHA4， ATXN2等20余种基因比率较低[1-5]。肌萎缩侧索硬化症病因涉及兴奋毒性、氧化应激、神经营养因子、自身免疫、中毒、感染等，目前无有效的治疗方法，仍然是 “不治之症”。

已发现的30种致病基因和修饰基因与ALS的病理发生有关，其机制可归纳为细胞表面受体、RNA加工、蛋白质合成、能量代谢、内质网功能、轴突转运等几个方面的异常。其中C9orf72和EPHA4分别参与了RNA加工、内质网、细胞膜受体三种ALS的发病机制。

C9orf72的第一外显子E1a和E1b之间有GGGGCC六个碱基的重复序列（HRE)，HRE拷贝数在人群中具有多态性，高于30个重复会有发生额颞叶痴呆（FTD）或ALS，在西方人群HER引起的ALS占了家族型病例的40%和散发型病例的7-10%， 台湾汉人中分别为18% 和2%， 我国目前研究较少，128个ALS-FTD 病人中发现2例[7-8]。可能汉人的频率比西方人低，但总体上仍然是最主要的致病基因，除次之外，HRE引起 30% 的FTD和1-2%的老年性痴呆（AD） [9]，我国的研究发现，HER结构也可能是帕金森的危险因素。C9orf72是与多种退行性神经疾病相关的重要致病基因和靶点。

C9orf72蛋白与细胞运输和自噬有关，敲低斑马鱼的C9orf72表达可干扰神经分支的形成和缩短运动神经元轴突[10，11]，推测HER导致ALS的致病机制有二个方面（1）HRE结构导致C9orf72转录子在细胞内的积累并与DNA形成RNA/DNA 杂交环（R-loop）引起RNA毒性；或导致不需要ATG的翻译（RANtranslation ）甘胺酸/精氨酸或脯氨酸/精氨酸的多肽的细胞毒性；（2） C9orf72表达水平降低影响了神经元内细胞运输[12-14]。

ALS动物模型是研究ALS的病因、病理、发病机制和治疗的重要工具。目前建立ALS的啮齿类动物模型主要是SOD1、TDP-43、VCP、FUS等基因的转基因或基因敲除小鼠，wobbler自发突变小鼠，不同模型病理表现不同，并各自局限性[15-17]。目前常用的啮齿类动物模型只反映了10%左右的病因，需要覆盖更广泛病因的和基因敲入动物模型的研制。

ALS之所以仍然是临床的“不治之症”的主要原因是其病因多样，目前对其机制了解少，针对性的发展相应的治疗靶点和药物比较困难。ALS疾病模型的不足也是ALS研究的限制限制因素之一。目前比较常用的模型综合起来涵盖的致病机制不超过10%。 建立能覆盖较大部分发病机制的ALS模型，可以极大地促进起发病机制研究、药物研发和治疗方法研究。

HRE序列多态性和基因缺失是目前国际公认的最普遍的ALS治病基因。在斑马鱼中敲低C9orf72基因和在果蝇中表达HER序列都能造成一定的神经表型，但与患者的基因结构不同，不能再现ALS表型[11，12]。将HER-GFP表达盒转入小鼠并没有ALS表型[18]，启示将HER结构敲入到C9orf72位点是造成ALS表型所必需的，但C9orf72的HER结构敲入和C9orf72敲除的哺乳动物模型尚未研制成功。

大鼠在生理、行为、神经等研究最常用的实验动物[21]，大鼠神经系统疾病模型不仅有好的行为学表现，也能表现一些在小鼠模型上不能表现的病理改变。我们推测C9ofr72基因修饰大鼠模型将比小鼠有更好的表型。 而我们实验室在国际上率先建立了系统的CRISPR/cas9 介导的、率的大鼠基因条件敲除、敲入技术体系[22]，建立C9ofr72基因修饰大鼠没有技术障碍。

综上，ALS影响的不仅仅是病人，也是对社会和家庭影响很大的“不治之症”，而目前国际上尚未建立基于C9orf72基因的哺乳类动物模型建立这类模型对我国ALS、FTD和AD等神经退行性疾病的医药研究具有重要的推动作用。

参考文献：

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3.Fishing forcauses and cures of motor neuron disorders. Dis Model Mech. 2014Jul;7(7):799-809

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7.Expanded GGGGCC hexanucleotide repeatin noncoding region of C9ORF72 causes chromosome 9p-linked FTD and ALS. Neuron. 2011， 20;72(2):245-56.

8.Ahexanucleotide repeat expansion in C9ORF72 causes familial and sporadic ALS inTaiwan. Neurobiol Aging. 2012，;33(9):2232.

9.Repeatexpansion in C9ORF72 in Alzheimer's disease. N Engl J Med. 2012,9;366(3):283-4.

10. C9ORF72, implicated in amytrophic (sic) lateral sclerosis andfrontotemporal dementia, regulates endosomal trafficking. Hum. Molec. Genet.23: 3579-3595, 2014.

11. Loss of function of C9orf72 causes motor deficits in a zebrafishmodel of amyotrophic lateral sclerosis. Ann. Neurol. 74: 180-187, 2013.

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13. C9orf72 nucleotiderepeat structures initiate molecular cascades of disease. Nature. 2014, 13;507(7491):195-200.

14. The C9orf72 GGGGCC repeat is translated into aggregatingdipeptide-repeat proteins in FTLD/ALS. Science 339: 1335-1338, 2013.

15. Neurodegenerativedisease: EPHA4 inhibition rescues neurodegeneration in ALS. Nat Rev Drug Discov. 2012 Oct;11(10):747.

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