C9ORF72基因HRE敲入大鼠模型

目前认为HER的致病机制有三个方面，其一是 HRE结构导致C9orf72 转录子在细胞内的积累，并可能与DNA形成RNA/DNA 杂交环（R-loop）引起RNA毒性。 第二种可能是HRE结构可能导致一种叫做不需要ATG的翻译（repeat-associated non-ATG (RAN)translation ）GGGGCC重复可以编码甘胺酸/精氨酸或脯氨酸/精氨酸的多肽，这两种多肽都有细胞毒性；其三是C9orf72蛋白本身的异常。由于美国科学家证实C9orf72基因敲除小鼠主要影响免疫系统，而不是神经系统。C9orf72蛋白本身的异常是否也参与ALS的病理发生仍然是有争议的科学问题。

C9ORF72-HRE转基因小鼠具有很明确的ALS的表型，但是该模型只适用于研究，RNA在核内的聚集以及蛋白异常结合引起的细胞毒性和ATG非依赖性的寡聚肽引起的细胞毒性。 C9orf72-HER敲入大鼠可能影响C9orf72蛋白本身的表达， 从而可以研究半合子效应导致的C9orf72蛋白本身的异常，以及是否参与ALS的病理发生。

C9ORF72基因HRE敲入大鼠中C9ORF72蛋白表达效率下降近50%，自4M开始出现运动功能障碍，随着年龄的增长，运动功能障碍逐渐加重，并有明显的渐进式下降趋势，12M后出现后肢瘫痪表型。C9orf72基因HRE敲入可导致运动神经元退变，运动神经元存活数量显著减少。

综上所述，我们的数据显示C9orf72基因HRE敲入可以导致ALS表型，C9orf72单倍体功能不全可能是导致肌萎缩性脊髓侧索硬化症的相关因素，提高运动神经元中C9orf72水平可作为一种可能的治疗策略进行检测。

SD大鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司【SCXK（京）2012-001】。实验中涉及动物的操作程序已获得中国医学科学院医学实验动物研究所实验动物使用与管理委员会的批准，批准号为ZLF18003. 本实验部分使用了基因修饰动物（基因HRE敲入），如果动物逃逸，将会造成的环境潜在的基因污染。实验动物饲养繁殖于屏障环境中，整个实验过程中保证动物处于监管状态，无逃脱可能。动物房出入口安放挡鼠板，严防动物逃逸，动物笼具一经发现破损，立即更换，饲养人员出入确保动物房门关紧并锁住等。含重组DNA的废弃核酸样品、离心管、枪头等用 1M NaOH溶液浸泡后，装入密封袋中，统一送到化学废弃物处理公司处理。

1，C9ORF72基因HRE敲入大鼠的建立

2，C9ORF72基因HRE敲入影响大鼠免疫功能

3，C9ORF72基因HRE敲入导致的运动缺陷

4，C9ORF72基因HRE敲入导致运动神经元丢失

5.1 C9ORF72基因HRE敲入大鼠的建立及大体特征

C9ORF72基因HRE敲入大鼠与野生型SD大鼠经杂交，仔代大鼠经提取基因组PCR鉴定基因型，包括野生型，HRE敲入杂合子。然后HRE敲入杂合子之间杂交获得HRE敲入纯合子。提取纯合子大鼠大脑、小脑、脊髓组织，进行免疫印迹观察C9ORF72蛋白表达情况，经结果图灰度扫描定量分析，HRE敲入导致C9ORF72蛋白表达效率下降近50%。

5.2 C9ORF72基因HRE敲入影响大鼠免疫功能

HRE敲入大鼠体重和生殖能力正常，但与野生型大鼠相比，免疫器官有改变，脾脏无明显变化，胸腺显著减小，颈部淋巴结明显增大。外周血流式分析显示4月龄的HRE敲入大鼠中性粒细胞比例显著上升，淋巴细胞中CD3、CD4均显著降低。至12个月龄，未发现其他器官有明显缺陷。

5.3 C9ORF72基因HRE敲入导致的运动缺陷

采用运动协调实验和肢体力量实验测定4M、8M、12M的WT和KI大鼠的运动功能。KI大鼠从4M开始出现运动功能障碍，随着年龄的增长，运动功能障碍逐渐加重，并有明显的渐进式下降趋势。与WT相比KI大鼠12M时运动协调和肢体力量下降分别为68%和56%。雌性KI大鼠在13-24M年龄段后肢麻痹发生率为25%(5/20)。这些数据表明，敲除大鼠的HRE插入不仅会导致运动障碍，还会导致后肢麻痹。

运动协调实验：两组动物分别测量4M、8M、12M三个时间点的从转棒仪掉落时间，实验前先进行4次适应性训练，正式实验300s为测量上限，每只动物重复三次，清理消毒后进行下一组，整个实验在安静环境下进行。（大小鼠转棒仪DXP-3，中国医学科学院药物研究所）

肢体力量实验：两组动物分别测量4M、8M、12M三个时间点的后肢抓力，每只动物重复三次。（抓力仪 bio-gs3 Bioseb US ）

5.4 C9ORF72基因HRE敲入导致运动神经元丢失

12M大鼠灌流固定取脊髓脊髓，计数腰椎脊髓节段处焦油紫染色的运动神经元数目，以确定其退变的程度。C9orf72基因HRE敲入引起运动神经元的退变，与WT相比，HRE敲入大鼠的运动神经元存活数量显著减少了47%。这一结果表明C9orf72基因HRE敲入可导致运动神经元退变，提示C9orf72基因HRE敲入增加了运动神经元对其他应力的敏感性。

神经元焦油紫（cresylviolet）染色：4%多聚甲醛灌流固定，取脊髓腰段，40um脊髓冰冻切片，脱水处理后-30℃保存。双蒸水配置焦油紫0.1%M/V，冰冻切片室温平衡后，PBS水化1min，0.1%焦油紫浸染2小时，双蒸水浸洗至组织呈深紫色，分化、脱水（过程中密切观察组织颜色，直至淡紫色），封片。

3.1实验材料

3.1.1实验动物

SD大鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司【SCXK（京）2012-001】。实验中涉及动物的操作程序已获得中国医学科学院医学实验动物研究所实验动物使用与管理委员会的批准，批准号为ZLF18003.

3.1.2实验仪器

3.1.3实验试剂

3.1.4模型构建流程

(1) 设计方案

(2) 构建sgRNA 载体pUC57-sgRNA expression vector，根据基因信息选择靶点并合成sgRNA。靶点1:AGTCCCACGAGGAAACAG CGG靶点2:AGGCAACCAGAGCGCTGG CGG(3) 合成的sgRNA单链通过退火复性结合成小片段，插入BSA I线性化的载体，构建完成的sgRNA载体通过体外转录成为可注射的sgRNA。(4) 构建Cas9载体pST1374-NLS-flag-linker-Cas9，载体通过体外转录成为可注射的Cas9-RNA。(5) 显微注射 1) 超数排卵：15只3-4周龄SD雌鼠注射激素进行超排。 2) 受精卵注射：取约150枚受精卵进行注射。 3) 雄鼠结扎：制作30只8周龄输精管结扎的SD雄鼠。 4) 受体鼠制备：8-10周龄SD雌鼠与结扎的SD雄鼠交配后选取见栓的雌鼠。 5) 胚胎移植：将注射后的受精卵移植到受体鼠输卵管壶腹部（移植一次，150枚卵，5只受体鼠）。(6) 基因型鉴定 1) 剪尾编号：出生7-10天的乳鼠，剪取脚趾和尾尖进行编号及取材。 2) 基因组DNA提取：使用基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA 3) PCR检测：根据序列信息设计检测引物并进行PCR检测。(7) 结果分析：选取通过PCR检测后含有不同于野生型分子量条带的鼠号，将PCR产物进行TA克隆，之后用检测引物进行菌液PCR，筛选有插入的克隆测序。(8) 根据测序结果确定C9ORF72基HRE敲入模型大鼠（SD. C9ORF72 (tm)-GC/ILAS，http://www.ratresource.com）用于后续实验。

一、疾病概述

肌萎缩侧索硬化（ALS）也叫运动神经元病（MND），后一名称英国常用，法国又叫夏科（Charcot）病，而美国也称卢伽雷（Lou Gehrig）病。我国通常将肌萎缩侧索硬化和运动神经元病混用。它是上运动神经元和下运动神经元损伤之后，导致包括球部（所谓球部，就是指的是延髓支配的这部分肌肉）、四肢、躯干、胸部腹部的肌肉逐渐无力和萎缩。患病率约为4-6/10万。大约10%的ALS病例是家族型的，90%是散发型的。

2018年5月11日，国家卫生健康委员会等5部门联合制定了《第一批罕见病目录》，肌萎缩侧索硬化被收录其中。

病因

肌萎缩侧索硬化的病因至今不明。20%的病例可能与遗传及基因缺陷有关。另外有部分环境因素，如重金属铝中毒等，都可能造成运动神经元损害。产生运动神经元损害的原因，目前主要理论有：神经毒性物质累积，谷氨酸堆积在神经细胞之间，久而久之，造成神经细胞的损伤；自由基使神经细胞膜受损；神经生长因子缺乏，使神经细胞无法持续生长、发育。

临床症状

该病早期症状轻微，易与其他疾病混淆。患者可能只是感到有一些无力、肉跳、容易疲劳等一些症状，渐渐进展为全身肌肉萎缩和吞咽困难。最后产生呼吸衰竭。

依临床症状大致可分为两型：

1.肢体起病型

症状首先是四肢肌肉进行性萎缩、无力，最后才产生呼吸衰竭。

2.延髓起病型

先期出现吞咽、讲话困难，很快进展为呼吸衰

诊断

要早期诊断肌萎缩侧索硬化，除了神经科临床检查外，还需做肌电图、神经传导速度检测、血清特殊抗体检查、腰穿脑脊液检查、影像学检查，甚至肌肉活检。

1.病史采集和神经系统检查

诊断过程的第一个重要步骤，就是由神经科医生进行的临床接诊。进行包括详细的现病史，家庭史，工作和环境接触史的采集。接诊过程中，神经科医生将寻找肌萎缩侧索硬化的典型表现：

（1）检查要评估咀嚼和吞咽的肌肉力量，包括口腔、舌及咽喉肌。

（2）下运动神经元（LMN）功能，如肌肉萎缩情况，肌肉力量或肌肉跳动（称为肌束震颤）。

（3）上运动神经元（UMN）功能，如腱反射亢进和肌肉痉挛（肌肉紧张和僵直的程度）

（4）情绪反应失去控制，如哭或笑的情绪变化。思维的变化如丧失判断力或失去基本的社会技能。检查者也会评估患者言语流畅性及文字识别能力。这些症状不常见，不容易引起重视。

（5）神经科医生还将询问如疼痛，感觉丧失或锥体外系问题。

2.辅助检查

诊断过程的下一步往往是一系列的辅助检查，如颈部MRI（磁共振成像）、头和腰MRI，EMG（肌电图）、神经传导速度和血液化验。有时会做基因检测或腰椎穿刺。

（1）磁共振成像（MRI）是一种无痛、非侵入性的检查，能非常详细提供脊髓和环绕、保护脊髓的骨骼及结缔组织的结构。将有助于除外对脊髓或主要神经的压迫（如突出的椎间盘）、多发性硬化、骨肿瘤压迫神经等异常、脊髓或脑中风。

（2）肌电图（EMG）是诊断过程一个非常重要的部分。该检查有时不舒服，但有必要完成。第一部分通过小型电极在特定部位发送刺激经过所检测的神经，在另一部位接受信号。根据所需时间测定传导速度以判断是否有神经损伤。第二部分测试选定肌肉的电活动。通过很细的针插入到选定的肌肉，并用它来“听”这些肌肉的电活动模式。

（3）血液、尿液和其他检查验血是为了筛查其他疾病，有些疾病症状类似肌萎缩侧索硬化早期迹象。这些检查包括甲状腺或甲状旁腺疾病、维生素B12缺乏、艾滋病毒感染、肝炎、自身免疫性疾病以及某些类型的癌症。肌酸激酶（CK）是肌肉受伤或死亡释放的酶，也常检查。其他还包括自身免疫抗体、抗-GM1抗体检测，寻找可能与某些癌症有关的血液标志物。根据患者工作和环境，也可能做重金属检测。如果家庭里其他成员患肌萎缩侧索硬化应该做肌萎缩侧索硬化基因检测。有时可能需要腰穿。有些患者除无力外，有疼痛或肌酸磷酸激酶（CK）非常高的表现，可能需要肌肉活检。

3.诊断

这些检查完成后，有经验的神经科大夫就可以判断患者是否为肌萎缩侧索硬化。有时确诊所需要的症状和检查结果并非都异常（尤其是在疾病的最早阶段）。在这种情况下，神经科大夫会检查建议随诊，3个月后重复体检和肌电图。

二、模型背景

1、基因信息

C9ORF72基因,Gene ID: 313155。

2、实验动物背景信息

SD大鼠

3、研究背景

肌萎缩侧索硬化症（ALS）是一种累进性神经退行疾病，以控制肌肉收缩的上、下运动神经元选择性退化和凋亡为特征，引发瘫痪、最终导致死亡，患病率约为4-6/10万。大约10%的ALS病例是家族型的，90%是散发型的。从发现SOD1基因突变到现在，共确定了30余种致病基因，其中C9orf72，FUS，TARDBP，SOD1等比例较高，而EPHA4， ATXN2等20余种基因比率较低[1-5]。肌萎缩侧索硬化症病因涉及兴奋毒性、氧化应激、神经营养因子、自身免疫、中毒、感染等，目前无有效的治疗方法，仍然是 “不治之症”。

已发现的30种致病基因和修饰基因与ALS的病理发生有关，其机制可归纳为细胞表面受体、RNA加工、蛋白质合成、能量代谢、内质网功能、轴突转运等几个方面的异常。其中C9orf72和EPHA4分别参与了RNA加工、内质网、细胞膜受体三种ALS的发病机制。

C9orf72的第一外显子E1a和E1b之间有GGGGCC六个碱基的重复序列（HRE)，HRE拷贝数在人群中具有多态性，高于30个重复会有发生额颞叶痴呆（FTD）或ALS，在西方人群HER引起的ALS占了家族型病例的40%和散发型病例的7-10%， 台湾汉人中分别为18% 和2%， 我国目前研究较少，128个ALS-FTD 病人中发现2例[7-8]。可能汉人的频率比西方人低，但总体上仍然是最主要的致病基因，除次之外，HRE引起 30% 的FTD和1-2%的老年性痴呆（AD） [9]，我国的研究发现，HER结构也可能是帕金森的危险因素。C9orf72是与多种退行性神经疾病相关的重要致病基因和靶点。

C9orf72蛋白与细胞运输和自噬有关，敲低斑马鱼的C9orf72表达可干扰神经分支的形成和缩短运动神经元轴突[10，11]，推测HER导致ALS的致病机制有二个方面（1）HRE结构导致C9orf72 转录子在细胞内的积累并与DNA形成RNA/DNA 杂交环（R-loop）引起RNA毒性；或导致不需要ATG的翻译（RAN translation ）甘胺酸/精氨酸或脯氨酸/精氨酸的多肽的细胞毒性；（2）C9orf72表达水平降低影响了神经元内细胞运输[12-14]。

ALS动物模型是研究ALS的病因、病理、发病机制和治疗的重要工具。目前建立ALS的啮齿类动物模型主要是SOD1、TDP-43、VCP、FUS等基因的转基因或基因敲除小鼠，wobbler自发突变小鼠，不同模型病理表现不同，并各自局限性[15-17]。目前常用的啮齿类动物模型只反映了10%左右的病因，需要覆盖更广泛病因的和基因敲入动物模型的研制。

ALS之所以仍然是临床的“不治之症”的主要原因是其病因多样，目前对其机制了解少，针对性的发展相应的治疗靶点和药物比较困难。 ALS疾病模型的不足也是ALS研究的限制限制因素之一。目前比较常用的模型综合起来涵盖的致病机制不超过10%。 建立能覆盖较大部分发病机制的ALS模型，可以极大地促进起发病机制研究、药物研发和治疗方法研究。

HRE序列多态性和基因缺失是目前国际公认的最普遍的ALS治病基因。在斑马鱼中敲低C9orf72基因和在果蝇中表达HER序列都能造成一定的神经表型，但与患者的基因结构不同，不能再现ALS表型[11，12]。将HER-GFP表达盒转入小鼠并没有ALS表型[18]，启示将HER结构敲入到C9orf72位点是造成ALS表型所必需的，但C9orf72的HER结构敲入和C9orf72敲除的哺乳动物模型尚未研制成功。

大鼠在生理、行为、神经等研究最常用的实验动物[21]，大鼠神经系统疾病模型不仅有好的行为学表现，也能表现一些在小鼠模型上不能表现的病理改变。我们推测C9ofr72基因修饰大鼠模型将比小鼠有更好的表型。 而我们实验室在国际上率先建立了系统的CRISPR/cas9 介导的、率的大鼠基因条件敲除、敲入技术体系[22]，建立C9ofr72基因修饰大鼠没有技术障碍。

综上，ALS影响的不仅仅是病人，也是对社会和家庭影响很大的“不治之症”，而目前国际上尚未建立基于C9orf72基因的哺乳类动物模型建立这类模型对我国ALS、FTD和AD等神经退行性疾病的医药研究具有重要的推动作用。

参考文献：

1.Amyotrophic lateral sclerosis associated with homozygosity for an asp90-to-ala mutation in CuZn-superoxide dismutase. Nature Genet. 10: 61-66, 1995

2.C9orf72 nucleotide repeat structures initiate molecular cascades of disease.Nature.2014，13;507(7491):195-200.

3.Fishing for causes and cures of motor neuron disorders. Dis Model Mech. 2014 Jul;7(7):799-809

4.Mutations of optineurin in amyotrophic lateral sclerosis.Nature. 2010 May 13;465(7295):223-6.

5.State of play in amyotrophic lateral sclerosis genetics.Nat Neurosci.2014;17(1):17-23.

6.A hexanucleotide repeat expansion in C9ORF72 is the cause of chromosome 9p21-linked ALS-FTD.Neuron. 2011，20;72(2):257-68.

7.Expanded GGGGCC hexanucleotide repeat in noncoding region of C9ORF72 causes chromosome 9p-linked FTD and ALS.Neuron. 2011，20;72(2):245-56.

8.A hexanucleotide repeat expansion in C9ORF72 causes familial and sporadic ALS in Taiwan.Neurobiol Aging.2012，;33(9):2232.

9.Repeat expansion in C9ORF72 in Alzheimer's disease.N Engl J Med. 2012, 9;366(3):283-4.

10.C9ORF72, implicated in amytrophic (sic) lateral sclerosis and frontotemporal dementia, regulates endosomal trafficking. Hum. Molec. Genet. 23: 3579-3595, 2014.

11.Loss of function of C9orf72 causes motor deficits in a zebrafish model of amyotrophic lateral sclerosis. Ann. Neurol. 74: 180-187, 2013.

12.C9orf72 repeat expansions cause neurodegeneration in Drosophila through arginine-rich proteins. Science. 2014, 345(6201):1192–1194.

13.C9orf72 nucleotide repeat structures initiate molecular cascades of disease.Nature. 2014, 13;507(7491):195-200.

14.The C9orf72 GGGGCC repeat is translated into aggregating dipeptide-repeat proteins in FTLD/ALS. Science 339: 1335-1338, 2013.

15.Neurodegenerative disease: EPHA4 inhibition rescues neurodegeneration in ALS.Nat Rev Drug Discov. 2012 Oct;11(10):747.

16.EPHA4 is a disease modifier of amyotrophic lateral sclerosis in animal models and in humans.Nat Med. 2012 Sep;18(9):1418-22.

17.GrimesMouse models of ciliopathies: the state of the art. Dis Model Mech. 2012, 5(3): 299–312.

18.Rodent models of amyotrophic lateral sclerosis. Biochimica et Biophysica Acta 1832 (2013) 1421–1436.

19.The wobbler mouse, an ALS animal model. Mol Genet Genomics. 2013; 288(5-6): 207–229.

20.A new inducible transgenic mouse model for C9orf72-associated GGGGCC repeat expansion supports a gain-of-function mechanism in C9orf72 associated ALS and FTD.Acta Neuropathol Commun. 2014, 13;2(1):166.

21.Laboratory animals: the Renaissance rat.Nature. 2004, 428(6982):464-6.)

22.Generating rats with conditional alleles using CRISPR/Cas9.Cell Res. 2014 , 24(1):122-5.