全身性Lep基因敲除小鼠模型

Lep基因缺失导致小鼠自发性肥胖，基因敲除的纯合子小鼠具有肥胖、嗜食、活性低、代谢效率高、产热受损、不孕和寿命短等表型，体重达到正常小鼠的三倍，影响糖尿病的严重程度和病程。与高脂饮食诱导的肥胖(DIO)小鼠相比，Lep基因敲除小鼠表现出不受调节的进食(贪食)，这导致肥胖、糖尿病和比DIO小鼠症状更为严重的疾病。

模型动物饲养在武汉大学人民医院动物房SPF级动物实验室，实验动物使用许可证SYXK（鄂）2015-0027。

（1）建筑特点

门采用专用净化密闭门并配备观察窗。单向走道呈顺时针走向设计。屏障系统内共有大鼠饲养室1间，小鼠饲养室3间，隔离观察室1间，实验准备室1间，洁物存放室1间，清洗消毒室1间。此外，屏障系统外配有监控室、机房和配电室等。

（2）设计参数

室内温度：20～26°C；日温差：≤4°C；相对湿度：40%～70%；换气次数：15～20次/h；气流速度：≤0．2m/s；压强梯度：20～50Pa；空气洁净度：7级；菌落数：≤3个/皿；氨浓度：≤14mg/m3；噪声：≤60dB；Z低工作照度：≥200lx；动物照度：15～20lx；昼夜明暗交替时间：12/12h。

（3）通风和空调系统

动物实验室采用全新风中央空调通风系统。空气经过初、中、三级过滤器后进入实验室内环境。

（4）照明系统

一更、淋浴、二更、气闸、清洁走道、洁物存放处、污物走道、缓冲间和清洗消毒间、动物饲养室、实验准备间、隔离观察室和功能实验室等安装有手动和自动开关，根据实际需要，调节控制室内照明灯。未启用房间、清洁走道、洁物存放处、污物走道等在每日中午12点和晚上8点开启紫外线灯照射1h。

（5）通讯系统

因为SPF级动物实验室的环境和设施具有特殊要求，人员进入后不能随意出入，而室内外的联系又十分重要，故室内各房间均安装内部电话机，按照房间顺序编排电话号码，各室内电话可相互连通，并均与监控室总机保持联系，保证实验室内外信息的及时沟通。

（6）监控系统

对SPF级动物实验室的出入口、走道、实验动物饲养室、功能操作室等重要位置均安装了可作270°旋转的摄像机，能够及时了解设施的运行状态；也能有效督促实验人员执行科学的操作规程，避免人为因素造成室内环境和设施的污染；并对整个实验期间的动物状态和反应进行观察，减少对动物的滋扰。

（7）供水系统

SPF级实验动物饮用水以纯净水为宜。本实验室采用管道供水，将处理后的纯净水用塑胶管道输送到屏障系统内实验准备室，设置接水槽，为实验动物供应灭菌的饮用水和屏障系统内用水。要经常更换和清洗输水管道，清洗笼具的用水添加适当比例的84消毒液。

（8）供电系统、警报系统和消防设施

SPF级动物实验室要求全天候不间断供风和供电，如果出现故障，不能及时发现和处理，就可能导致环境设施的污染、动物感染或死亡，造成严重后果。因此应对SPF级动物实验室使用独立稳定的供电系统，并配备有应急电源。在中央空调机房控制室安装风机故障警报系统，以便及时检修和维护，保证设施的安全运行。

（9）消毒灭菌设备

为防止外界物品进入SPF级动物实验室时所携带的细菌污染室内环境和造成动物交叉感染，按照不同物品的特性，进行紫外线照射消毒、渡槽消毒液消毒或专用的机动门真空灭菌器消毒。

（10）动物饲养笼具

饲养大、小鼠的笼具聚碳酸脂材料的塑胶笼具，具有高透明、耐高压、耐高温、耐酸碱等特点。通用的不锈钢笼具长、宽、高分别为40、30、20cm，适用于单笼饲养有特殊要求的实验动物，配有底盘和食槽，确保实验动物有充足的采食和活动空间，同时也保证室内环境的清洁。

（11）垫料的选择和使用

在使用塑胶垫料时，垫料是大小鼠直接接触的铺垫物，起到吸湿、保暖和造窝的作用。垫料的好坏直接影响到大小鼠术后的恢复、生长发育和繁殖性能。目前，所使用的垫料主要有玉米秸垫料、刨花垫料。

（12）饲料配制

大小鼠的生产型饲料和维持型饲料必须严格按照国家标准，进行科学配制生产。每半年检测一次饲料的微生物指标和有效营养成分指标，保证饲料的质量。

全身性lep基因敲除小鼠采用PCR方式进行鉴定。

（1）引物信息：见表4

（2）PCR结果：见图1-5#、7-10#小鼠PCR结果符合要求，需进一步测序鉴定。

图2. F/R 检测Lep基因删除情况

（3）测序结果：通过峰形分析，可以将突变型的DNA 序列（红色箭头所指峰形）分析出来。结果为AGGAGGGGCCAGCC 前的缺失约3162bp,发生片段敲除。具体见图3。说明全身性Lep基因敲除小鼠构建成功。

模型背景：C57BL/6J小鼠

模型制作方法：

（1）根据Lep 的基因组序列结构，设计CRISPR 靶点：

根据目前基因组数据，Lep 基因存在2 个转录产物，见下图：

http://asia.ensembl.org/Mus_musculus/Gene/Summary?db=core;g=ENSMUSG00000059201;r=6:29060220-29073877

Lep 保守区域分析：

根据Lep 基因组结构和蛋白功能保守区，Lep 有2 个转录产物。选取Lep-201进行设计，Exon2-3(aa1-167)，为编码蛋白的转录产物的外显子,而且也是Lep 基因所有转录本Lep-202 的全部的外显子序列，删除这Exon2-3 后，翻译该蛋白的mRNA 将不会被转录出来，而且该基因被完全敲除。因此决定在Exon2-3 的两边设计靶点，实现Exon2-3 敲除。

下面将根据Exon8 设计条件性敲除方案。

转录产物Lep-201 的基因组结构：

（2）F0 代构建及繁殖：

基因敲除构建设计。

肥胖是指身体超重，脂肪异常堆积的状态。肥胖与多种疾病有关，如糖尿病、某些癌症、高血压和心血管疾病。肥胖一直被认为是由个人习惯造成的，主要是热量摄入过多和缺乏锻炼。此外，遗传成分，如遗传缺陷和遗传变异，包括瘦素基因突变，也可能对超重和肥胖的发展有强大的作用等。瘦蛋白是一种由白色脂肪细胞、骨骼肌、胎盘和垂体等组织产生的激素，主要由脂肪组织分泌；影响下丘脑，调节食欲和能量平衡，从而导致体重增加。同时，瘦蛋白对于维持垂体GH细胞及其功能也很重要。当促生长激素细胞的瘦蛋白受体发生缺失，则导致GH细胞数量减少、循环生长激素减少，最终引起成体性肥胖。Lep基因缺失导致小鼠自发性肥胖，基因敲除的纯合子小鼠具有肥胖、嗜食、活性低、代谢效率高、产热受损、不孕和寿命短等表型，体重达到正常小鼠的三倍，影响糖尿病的严重程度和病程。与高脂饮食诱导的肥胖(DIO)小鼠相比，Lep基因敲除小鼠表现出不受调节的进食(贪食)，这导致肥胖、糖尿病和比DIO小鼠症状更为严重的疾病。