条件性Enpp1-Floxp敲除小鼠模型

Enpp1基因编码的蛋白是一种II型跨膜糖蛋白，属于核苷焦磷酸酶/磷酸二酯酶家族，最早发现于浆细胞（PC）中；在许多非淋巴组织中表达，包括软骨、心脏、肾脏、肝脏和唾液腺，并在软骨细胞、成骨细胞和血管平滑肌细胞中高表达；参与多种生物学途径。对于Enpp1基因进行失活突变或基因沉默的小鼠，由于关节和椎旁韧带过度钙化，表现出“关节僵硬”和“踮脚走路”的表型。Enpp1突变也会导致小鼠和人类的血管钙化，导致人类常染色体隐性低磷血症性佝偻病(ARHR)或婴儿期广义动脉钙化(GACI)。Enpp1突变模型也表现出过早老化的表型，如寿命短和动脉硬化，可应用于衰老研究。

模型动物饲养在武汉大学人民医院动物房SPF级动物实验室，实验动物使用许可证SYXK（鄂）2015-0027。

（1）建筑特点

门采用专用净化密闭门并配备观察窗。单向走道呈顺时针走向设计。屏障系统内共有大鼠饲养室1间，小鼠饲养室3间，隔离观察室1间，实验准备室1间，洁物存放室1间，清洗消毒室1间。此外，屏障系统外配有监控室、机房和配电室等。

（2）设计参数

室内温度：20～26°C；日温差：≤4°C；相对湿度：40%～70%；换气次数：15～20次/h；气流速度：≤0．2m/s；压强梯度：20～50Pa；空气洁净度：7级；菌落数：≤3个/皿；氨浓度：≤14mg/m3；噪声：≤60dB；Z低工作照度：≥200lx；动物照度：15～20lx；昼夜明暗交替时间：12/12h。

（3）通风和空调系统

动物实验室采用全新风中央空调通风系统。空气经过初、中、三级过滤器后进入实验室内环境。

（4）照明系统

一更、淋浴、二更、气闸、清洁走道、洁物存放处、污物走道、缓冲间和清洗消毒间、动物饲养室、实验准备间、隔离观察室和功能实验室等安装有手动和自动开关，根据实际需要，调节控制室内照明灯。未启用房间、清洁走道、洁物存放处、污物走道等在每日中午12点和晚上8点开启紫外线灯照射1h。

（5）通讯系统

因为SPF级动物实验室的环境和设施具有特殊要求，人员进入后不能随意出入，而室内外的联系又十分重要，故室内各房间均安装内部电话机，按照房间顺序编排电话号码，各室内电话可相互连通，并均与监控室总机保持联系，保证实验室内外信息的及时沟通。

（6）监控系统

对SPF级动物实验室的出入口、走道、实验动物饲养室、功能操作室等重要位置均安装了可作270°旋转的摄像机，能够及时了解设施的运行状态；也能有效督促实验人员执行科学的操作规程，避免人为因素造成室内环境和设施的污染；并对整个实验期间的动物状态和反应进行观察，减少对动物的滋扰。

（7）供水系统

SPF级实验动物饮用水以纯净水为宜。本实验室采用管道供水，将处理后的纯净水用塑胶管道输送到屏障系统内实验准备室，设置接水槽，为实验动物供应灭菌的饮用水和屏障系统内用水。要经常更换和清洗输水管道，清洗笼具的用水添加适当比例的84消毒液。

（8）供电系统、警报系统和消防设施

SPF级动物实验室要求全天候不间断供风和供电，如果出现故障，不能及时发现和处理，就可能导致环境设施的污染、动物感染或死亡，造成严重后果。因此应对SPF级动物实验室使用独立稳定的供电系统，并配备有应急电源。在中央空调机房控制室安装风机故障警报系统，以便及时检修和维护，保证设施的安全运行。

（9）消毒灭菌设备

为防止外界物品进入SPF级动物实验室时所携带的细菌污染室内环境和造成动物交叉感染，按照不同物品的特性，进行紫外线照射消毒、渡槽消毒液消毒或专用的机动门真空灭菌器消毒。

（10）动物饲养笼具

饲养大、小鼠的笼具聚碳酸脂材料的塑胶笼具，具有高透明、耐高压、耐高温、耐酸碱等特点。通用的不锈钢笼具长、宽、高分别为40、30、20cm，适用于单笼饲养有特殊要求的实验动物，配有底盘和食槽，确保实验动物有充足的采食和活动空间，同时也保证室内环境的清洁。

（11）垫料的选择和使用

在使用塑胶垫料时，垫料是大小鼠直接接触的铺垫物，起到吸湿、保暖和造窝的作用。垫料的好坏直接影响到大小鼠术后的恢复、生长发育和繁殖性能。目前，所使用的垫料主要有玉米秸垫料、刨花垫料。

（12）饲料配制

大小鼠的生产型饲料和维持型饲料必须严格按照国家标准，进行科学配制生产。每半年检测一次饲料的微生物指标和有效营养成分指标，保证饲料的质量。

条件性Enpp1-Floxp敲除小鼠杂合子采用PCR方式进行基因敲除的鉴定。

（1）引物信息：见表1

表4. 鉴定引物序列

引物不同组合检测分析：

F1+R1引物PCR检测L端floxp插入情况：

①纯合子（f/f）：只有一条KI：225 bp带

②杂合子（f/w）：两条带，一条为KI：225 bp，一条为WT：191 bp

③野生型（wt）：只有一条WT：225 bp带

F2+R2引物PCR检测R端floxp插入情况：

①纯合子（f/f）：只有一条KI：236 bp带

②杂合子（f/w）：两条带，一条为KI：236 bp，一条为WT：202 bp

③野生型（wt）：只有一条WT：202 bp带

F+R引物PCR检测两端floxp插入情况：

需要测序判断，测序引物为F(或R1)和F(或F2)

①纯合子（f/f）：测序峰型为单峰，比对与Donor序列一致，插入两个floxp序列

②杂合子（f/w）：测序峰型为双峰，能读出含有floxp序列的套峰

③野生型（wt）：测序峰型为单峰，比对与野生型序列一致

测序结果：将F/R 引物扩增的PCR 产物测序确认该小鼠为均为两端准确插入floxp列的杂合子，具体见图3。黑色箭头代表野生型序列，红色箭头代表插入的序列，L端和R端测序的峰形分析，都可确认该小鼠floxp序列（ATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTAT）准确插入指定位置。说明条件性Enpp1-floxp敲除小鼠构建成功。

L端floxp插入分析（测序引物：F）

R端flxop插入分析（测序引物：R）

图3. F/R 引物扩增的PCR 产物测序结果

基因敲除构建设计：

低磷性佝偻病（Hypophosphatemicriskers）是儿童常见的代谢性骨病，是由于各种原因引起肾小管对磷的重吸收障碍，从而导致骨发育不良的一组肾失磷性代谢性骨病，临床表现为低磷血症、身材矮小、双下肢骨骼畸形。儿童期的低磷性佝偻病多为遗传性，包括常染色体显性遗传（ADHR）、常染色体隐性遗传（ARHR）、X连锁遗传（XLHR）、伴高钙尿症的遗传性低磷性佝偻病（HHRH）等。Enpp1基因是已确定的可导致低磷性佝偻病的基因之一，属于常染色体隐性遗传。婴儿全身动脉钙化(Generalized Arterial Calcification of Infancy，GACI)是少见的疾病，其特点是伴不规则内膜增厚的弥漫性动脉钙化，冠状动脉受累，通常在9个月前死亡。Enpp1基因也被证实与GACI有关。它编码的蛋白是一种II型跨膜糖蛋白，属于核苷焦磷酸酶/磷酸二酯酶家族，最早发现于浆细胞（PC）中；在许多非淋巴组织中表达，包括软骨、心脏、肾脏、肝脏和唾液腺，并在软骨细胞、成骨细胞和血管平滑肌细胞中高表达；参与多种生物学途径。首先，ENPP1蛋白具有广泛的底物特异性，包括ATP、UTP、cAMP和2'3'-cGAMP。该酶催化5' -磷酸二酯酶键，主要在ATP中，生成核苷5'-单磷酸和无机焦磷酸盐(PPi)，后者是骨形成过程中矿物结晶的抑制剂。对于Enpp1基因进行失活突变或基因沉默的小鼠，由于关节和椎旁韧带过度钙化，表现出“关节僵硬”和“踮脚走路”的表型。Enpp1突变也会导致小鼠和人类的血管钙化，导致人类常染色体隐性低磷血症性佝偻病(ARHR)或婴儿期广义动脉钙化(GACI)。其次，ENPP1通过将ATP分解为AMP来介导核苷酸循环，而AMP再被5'核苷酸酶转化为腺苷，腺苷则被自由地运输到细胞中进行新陈代谢。ATP和腺苷都具有免疫调节功能。第三，ENPP1参与脂肪细胞分化，并在碳水化合物代谢和胰岛素抵抗中发挥作用；ENPP1与胰岛素受体结合，抑制下游信号通路，从而诱导胰岛素抵抗和葡萄糖耐受。第四，ENPP1对于正常B细胞的发育是必不可少的，而且对于长寿浆细胞（LLPC）的发育和生存更是至关重要。Enpp1突变模型也应用于衰老研究。