MIP基因敲除小鼠模型

健明迪检测提供的MIP基因敲除小鼠模型,讨论与结论 该基因敲除小鼠可用于研究炎性疾病中的趋化因子受体。 生物安全性 动物模型的制备和应用实验必须在具备相应资质的实验室开展,具有CMA,CNAS认证资质。
MIP基因敲除小鼠模型
我们的服务 MIP基因敲除小鼠模型

讨论与结论

该基因敲除小鼠可用于研究炎性疾病中的趋化因子受体。

生物安全性

动物模型的制备和应用实验必须在具备相应资质的实验室开展。动物模型的制备、应用过程中的监督管理、处置措施、对环境和生态影响等应符合国家相关法律规定。

评价验证

Ccl3(趋化因子[C-C基序]配体3)(也称为巨噬细胞炎性蛋白1a,Mip1a或Scya3)纯合的小鼠敲除突变是可行且可育的。纯合突变小鼠对柯萨奇病毒诱导的心肌炎有抵抗力。感染了流感病毒的突变小鼠显示出减少的肺炎和延迟的病毒清除。没有明显的造血异常。在Ccl3tm1小鼠中,正畸牙齿移动过程中机械负荷引起的骨重塑显着降低。与野生型小鼠相比,用四氯化碳或蛋氨酸和胆碱缺乏饮食诱导肝纤维化可减少肝纤维化。在这些基因敲除小鼠中,黑色素瘤的生长增强,肺转移增强。然而,对于肾细胞癌,在这些基因缺陷的小鼠中,肺中转移灶的数量减少了,并且肿瘤内新血管形成(一种不可或缺的转移过程)减弱了。

制备方法

实验动物:野生型AB品系斑马鱼,养殖温度为28.5℃。

1.斑马鱼npsn的基因信息以及Cas9靶位点的确立

根据Ensembl数据库信息,npsn位于斑马鱼第7号染色体上,含有4个转录本,其中3个转录本npsn-001、-002和-003可以编码蛋白质,转录本npsn-004不可以编码蛋白。我们通过对各个编码蛋白转录本的cDNA序列比对,发现三个转录本的编码序列(coding sequence,CDS)大体相同,起始密码子的位置都位于外显子2上,由于剪切方式的不同产生了不同的终止子(如图2所示)。

根据npsn各转录本编码蛋白的共有序列以及Npsn蛋白的功能域预测,我们在npsn基因外显子5和外显子6上选取npsn-Cas9的靶位点(如图2所示)。其中在npsn-exon5上选取的Cas9靶位点序列为5’-GGAGACATCGCCTTTCCCAG-3’,在npsn-exon6上选取的Cas9靶位点序列为5’-GGTCAGGTCGTGTCTCTCCAG-3’。

2. 用于CRISPER/Cas9敲除实验斑马鱼的准备及靶位点SNP的检测

首先挑选20对3 - 5月龄体型正常的AB野生型斑马鱼,并且每个Cas9靶位点预准备10对斑马鱼进行Cas9靶位点处是否存在SNP的检测。我们首先在每个Cas9靶位点附近设计PCR引物,

其中在npsn-exon5-Cas9处设计引物序列为:

F: 5’-GGACAGTGCTATTGCGTTTGG-3’,

R: 5’-GCCTTGTTCAATCACTGCTACTTC-3’,PCR产物长度为435 bp;

在npsn-exon6-Cas9处引物序列为:

F: 5’-TGCATTTTCTGTCATTTTCCTGTG-3’,

R: 5’-TGTTCTGATAGAGGATCCGGATG-3’,PCR产物长度为267 bp。

用眼科剪剪取少量斑马鱼尾鳍组织,先加入20 uL碱液(25 mM NaOH+ 200μM的EDTA(~ PH 12)),将样品置于95 ℃水浴锅中裂解30分钟,在振荡器上震碎组织,然后加入等体积的中和液40 mM的中和液(TRIS-HCL(~ PH 5)),离心,取上清液作为PCR反应中的DNA模板。PCR反应体系与反应条件如下:

PCR反应结束后,用1%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的大小是否正确以及条带是否特异。若PCR产物大小正确,并且条带特异,可以将PCR产物送去公司进行测序。根据测序结果,将PCR产物中有SNP的斑马鱼舍弃,留下无SNP的亲本进行下步npsn-Cas9敲除实验。同时送公司合成用于gRNA的制备的长片段引物FP(oligo),

其中npsn-exon5 oligo的序列为:

5’-TAATACGACTCACTATAggagacatcgcctttcccagGTTTTAGAGCTAGAAATAGC-3’(T7启动子序列 + Cas9靶位点序列 + gRNA - FP);

npsn-exon6 oligo的序列为:

5’- TAATACGACTCACTATAggtcaggtcgtgtctctccagGTTTTAGAGCTAGAAATAGC-3’。

3. Cas9 mRNA以及gRNA的制备

3.1 Cas9 mRNA的合成

1)pSP6-2sNLS-spCas9 载体的线性化:

10X CutSmart® Buffer:5 uL

Xba I: 1 uL

DNA (pSP6-2sNLS-spCas9): 2 ug

ddH2O: up to 50 uL

37 ℃孵育4小时,取少量酶切产物电泳确定是否线性化完全,然后直接回收线性化产物。

2)体外转录合成Cas9 mRNA:

按照SP6体外转录试剂盒(Ambion,AM1340)的说明进行体外转录。转录结束后,利用微量分光光度计检测合成的Cas9 mRNA的浓度,然后将mRNA稀释成600 ng/uL,并且分装后于- 80 ℃冰箱长期保存。

3.2 gRNA的制备

1)gRNA DNA模板的制备:

取5 uL PCR产物进行DNA琼脂糖凝胶电泳来分析目的条带是否单一,并且将PCR产物纯化回收,用微量分光光度计分析回收产物的浓度,此DNA片段作为下步gRNA体外转录的模板。

2)gRNA的体外转录合成:

表1-2-3. 体外转录体系

Tab.1-2-3 in vitro transcription system

反应体系混匀后,置于37 ℃孵育4 - 5小时。加入2 uL DNase I消化去除DNA模板,并且取1 uL反应液进行1 %琼脂糖凝胶电泳,检测模板DNA是否消化完全,以及大体估测产物gRNA的浓度。

3)gRNA的纯化:

转录体系(20 uL)每管加500 uL TRIzol 试剂,震荡混匀;

加100 uL三氯甲烷,手动摇晃15 s,常温静置3 min;

12000 X g,4度,离心15分钟,取上清于新的EP管中;

加入等体积的异丙醇溶液,震荡混匀,静置10 min;

12000 X g,4度,离心10分钟,去上清液,留沉淀;

向沉淀中加入1 mL的75 %的乙醇(溶于DEPC处理过的H2O),震荡混匀;

12000 X g,4度,离心5分钟,去上清液,留沉淀;

待乙醇挥发干净,加入5 uL的DEPC处理过的H2O;

用微量分光光度计测RNA的浓度,琼脂糖凝胶电泳,以及稀释成不同浓度的RNA用于显微注射,剩余RNA储液置于- 80 ℃冰箱内长期保存。

3.3显微注射

将Cas9mRNA(300 ng/ul)和gRNA(不同浓度梯度)按照体积比1 : 1混合,通过显微注射方式注射入单细胞时期(出生后半小时内)的斑马鱼鱼卵中,液滴体积大小大约为0.5 nL。显微注射后,更换新鲜的胚胎培养液。并且待胚胎发育至原肠胚时期,用吸管吸走死亡的胚胎,将存活的胚胎再次更换新鲜的胚胎培养液。

3.4 Cas9靶位点效率的检测

采用T7 核酸内切酶 I酶切法检测Cas9靶位点的效率,T7 核酸内切酶 I 可以识别并切割不完全配对 DNA、十字型结构 DNA、Holliday 结构或交叉 DNA、异源双链DNA 或者以更慢的速度切割或切刻双链 DNA,因此常用于突变体的检测。具体如下:

取20颗大约24 hpf的小鱼胚胎分别放置于96孔PCR板中,并且取4颗AB野生型胚胎作为对照组。吸干胚胎培养液,每孔加入20 uL的组织裂解液,样品置于95 ℃水浴锅内裂解30分钟,在振荡器上震碎组织,然后加入等体积的中和液,离心,取上清液作为PCR模板。PCR反应条件如下:

扩增PCR产物利用DNA琼脂糖凝胶电泳检测产物的特异性,将剩余的PCR产物置于98 ℃水浴锅中水浴10分钟(充分打开DNA的二级结构),使其缓慢将至室温,然后进行T7 核酸内切酶 I酶切反应,酶切体系如下:

10 X NEB Buffer 2.1: 1 uL

PCR 产物: 4uL

T7E1酶:0.2 uL

ddH2O:up to 10 uL

37 ℃孵育2小时,电泳,确定条带是否被切开,其中前20孔样品是打了Cas9的实验组,后四个样品为AB对照组。

npsn-exon5-Cas9的PCR产物大小为435 bp,对照组未被切开,进一步说明了在此片段中不存在SNP,而实验组有部分DNA被切成220 bp左右的片段,这说明Cas9 mRNA在靶点处进行了切割,并且产生了突变,并且根据DNA电泳条带的亮度估测此位点的突变效率大约70 %(如图3所示)。

npsn-exon6-Cas9的PCR产物大小为267 bp,对照组未被切开,进一步说明了在此片段中不存在SNP,而实验组有部分DNA被切成150 bp和120 bp的DNA片段,这说明Cas9 mRNA在靶点处进行了切割,并且产生了突变,并且根据DNA电泳条带的亮度估测此位点的突变效率大约50 %(如图4所示)。

图3. npsn-exon5-cas9靶位点效率检测结果

图4. npsn-exon6-cas9靶位点效率检测结果

4. 斑马鱼组织DNA的粗提。

1)将50 X的组织裂解液稀释成1 X的工作液(吸取200 uL 50 X组织裂解液,加入去离子水稀释到10 mL溶液);将50 X的中和液稀释成1 X的工作液(吸取200 uL 50 X中和液,加入去离子水稀释到10 mL溶液)

2)用吸管吸取斑马鱼胚胎于EP管中,并且用小量程的枪小心吸走多余液体,加入20 uL组织裂解液;

3)将EP管放入95 ℃水浴锅内裂解30分钟;

4)震荡EP管,使组织充分裂解;

5)向EP管中加入相同体积的中和液,震荡混匀并且离心;

6)吸取上清液即可作为PCR反应的模板。

5.npsn缺陷斑马鱼模型构建结果检测

我们设计Cas9靶点在npsn的exon5和exon6上,其中npsn-exon5-Cas9靶点获得(-7,+0)突变体(称为npsnsmu5)(如图5 A所示),在npsn-exon6-Cas9靶点获得(-0,+1)突变体(称为npsnsmu6)(如图5 B所示)。npsnsmu5和npsnsmu6的纯合突变体形态正常,能够存活至成年,并且正常的进行繁殖。

6.突变体中npsn mRNA表达变化检测

为了检测突变体中npsn mRNA的表达是否发生改变,我们利用npsn的整体原位杂交技术检测npsnsmu5突变体中npsn mRNA的表达。结果显示,在npsnsmu5突变体中,npsn信号点几乎检测不到(如图6 A所示),在npsnsmu6突变体中同样出现npsn信号点的缺失。为了检测npsnsmu5突变体中npsn是发生了部分降解还是全面降解,我们在突变位点的前面、后面以及包含突变点处分别设计qPCR的引物,经qRT-PCR检测发现,npsnsmu5中npsn的表达都下降到原来的5 %左右(如图6 B所示),这说明npsnsmu5突变体中npsn mRNA发生了全面降解,这种降解可能是由于无义突变介导mRNA降解(nonsense-mediated decay, NMD)引起的。

图6. npsnsmu5突变体中npsn mRNA发生降解。

A. 3 dpf npsnsmu5突变体和同胞的npsn整体原位杂交。B. qRT-PCR检测npsnsmu5突变体和同胞中npsn表达量的变化。

研究背景

使用新霉素选择盒替换目的基因5'非翻译区的300个核苷酸的区域,全部外显子1和部分外显子2。将正确靶向的129个ES细胞注射入C57BL / 6J胚泡。

模型信息

中文名称:MIP基因敲除小鼠模型

英文名称:B6.129P2-Scya3

类型:免疫缺陷动物模型

分级:NA

用途:该基因敲除小鼠可用于研究炎性疾病中的趋化因子受体。

研制单位:中国医学科学院医学实验动物研究所

保存单位:中国医学科学院医学实验动物研究所

哪里可以做MIP基因敲除小鼠模型服务?研究用途:该基因敲除小鼠可用于研究炎性疾病中的趋化因子受体。
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