MIP基因敲除小鼠模型

该基因敲除小鼠可用于研究炎性疾病中的趋化因子受体。

动物模型的制备和应用实验必须在具备相应资质的实验室开展。动物模型的制备、应用过程中的监督管理、处置措施、对环境和生态影响等应符合国家相关法律规定。

Ccl3（趋化因子[C-C基序]配体3）（也称为巨噬细胞炎性蛋白1a，Mip1a或Scya3）纯合的小鼠敲除突变是可行且可育的。纯合突变小鼠对柯萨奇病毒诱导的心肌炎有抵抗力。感染了流感病毒的突变小鼠显示出减少的肺炎和延迟的病毒清除。没有明显的造血异常。在Ccl3tm1小鼠中，正畸牙齿移动过程中机械负荷引起的骨重塑显着降低。与野生型小鼠相比，用四氯化碳或蛋氨酸和胆碱缺乏饮食诱导肝纤维化可减少肝纤维化。在这些基因敲除小鼠中，黑色素瘤的生长增强，肺转移增强。然而，对于肾细胞癌，在这些基因缺陷的小鼠中，肺中转移灶的数量减少了，并且肿瘤内新血管形成（一种不可或缺的转移过程）减弱了。

实验动物：野生型AB品系斑马鱼，养殖温度为28.5℃。

1.斑马鱼npsn的基因信息以及Cas9靶位点的确立

根据Ensembl数据库信息，npsn位于斑马鱼第7号染色体上，含有4个转录本，其中3个转录本npsn-001、-002和-003可以编码蛋白质，转录本npsn-004不可以编码蛋白。我们通过对各个编码蛋白转录本的cDNA序列比对，发现三个转录本的编码序列（coding sequence，CDS）大体相同，起始密码子的位置都位于外显子2上，由于剪切方式的不同产生了不同的终止子（如图2所示）。

根据npsn各转录本编码蛋白的共有序列以及Npsn蛋白的功能域预测，我们在npsn基因外显子5和外显子6上选取npsn-Cas9的靶位点（如图2所示）。其中在npsn-exon5上选取的Cas9靶位点序列为5’-GGAGACATCGCCTTTCCCAG-3’，在npsn-exon6上选取的Cas9靶位点序列为5’-GGTCAGGTCGTGTCTCTCCAG-3’。

2. 用于CRISPER/Cas9敲除实验斑马鱼的准备及靶位点SNP的检测

首先挑选20对3 - 5月龄体型正常的AB野生型斑马鱼，并且每个Cas9靶位点预准备10对斑马鱼进行Cas9靶位点处是否存在SNP的检测。我们首先在每个Cas9靶位点附近设计PCR引物，

其中在npsn-exon5-Cas9处设计引物序列为：

F: 5’-GGACAGTGCTATTGCGTTTGG-3’，

R: 5’-GCCTTGTTCAATCACTGCTACTTC-3’，PCR产物长度为435 bp；

在npsn-exon6-Cas9处引物序列为：

F: 5’-TGCATTTTCTGTCATTTTCCTGTG-3’，

R: 5’-TGTTCTGATAGAGGATCCGGATG-3’，PCR产物长度为267 bp。

用眼科剪剪取少量斑马鱼尾鳍组织，先加入20 uL碱液（25 mM NaOH+ 200μM的EDTA（~ PH 12）），将样品置于95 ℃水浴锅中裂解30分钟，在振荡器上震碎组织，然后加入等体积的中和液40 mM的中和液（TRIS-HCL(~ PH 5)），离心，取上清液作为PCR反应中的DNA模板。PCR反应体系与反应条件如下：

PCR反应结束后，用1%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的大小是否正确以及条带是否特异。若PCR产物大小正确，并且条带特异，可以将PCR产物送去公司进行测序。根据测序结果，将PCR产物中有SNP的斑马鱼舍弃，留下无SNP的亲本进行下步npsn-Cas9敲除实验。同时送公司合成用于gRNA的制备的长片段引物FP（oligo），

其中npsn-exon5 oligo的序列为：

5’-TAATACGACTCACTATAggagacatcgcctttcccagGTTTTAGAGCTAGAAATAGC-3’（T7启动子序列 + Cas9靶位点序列 + gRNA - FP）；

npsn-exon6 oligo的序列为：

5’- TAATACGACTCACTATAggtcaggtcgtgtctctccagGTTTTAGAGCTAGAAATAGC-3’。

3. Cas9 mRNA以及gRNA的制备

3.1 Cas9 mRNA的合成

1）pSP6-2sNLS-spCas9 载体的线性化：

10X CutSmart® Buffer：5 uL

Xba I： 1 uL

DNA (pSP6-2sNLS-spCas9)： 2 ug

ddH2O： up to 50 uL

37 ℃孵育4小时，取少量酶切产物电泳确定是否线性化完全，然后直接回收线性化产物。

2）体外转录合成Cas9 mRNA：

按照SP6体外转录试剂盒（Ambion，AM1340）的说明进行体外转录。转录结束后，利用微量分光光度计检测合成的Cas9 mRNA的浓度，然后将mRNA稀释成600 ng/uL，并且分装后于- 80 ℃冰箱长期保存。

3.2 gRNA的制备

1）gRNA DNA模板的制备：

取5 uL PCR产物进行DNA琼脂糖凝胶电泳来分析目的条带是否单一，并且将PCR产物纯化回收，用微量分光光度计分析回收产物的浓度，此DNA片段作为下步gRNA体外转录的模板。

2）gRNA的体外转录合成：

表1-2-3. 体外转录体系

Tab.1-2-3 in vitro transcription system

反应体系混匀后，置于37 ℃孵育4 - 5小时。加入2 uL DNase I消化去除DNA模板，并且取1 uL反应液进行1 %琼脂糖凝胶电泳，检测模板DNA是否消化完全，以及大体估测产物gRNA的浓度。

3）gRNA的纯化：

转录体系（20 uL）每管加500 uL TRIzol 试剂，震荡混匀；

加100 uL三氯甲烷，手动摇晃15 s，常温静置3 min；

12000 X g，4度，离心15分钟，取上清于新的EP管中；

加入等体积的异丙醇溶液，震荡混匀，静置10 min；

12000 X g，4度，离心10分钟，去上清液，留沉淀；

向沉淀中加入1 mL的75 %的乙醇(溶于DEPC处理过的H2O)，震荡混匀；

12000 X g，4度，离心5分钟，去上清液，留沉淀；

待乙醇挥发干净，加入5 uL的DEPC处理过的H2O；

用微量分光光度计测RNA的浓度，琼脂糖凝胶电泳，以及稀释成不同浓度的RNA用于显微注射，剩余RNA储液置于- 80 ℃冰箱内长期保存。

3.3显微注射

将Cas9mRNA（300 ng/ul）和gRNA（不同浓度梯度）按照体积比1 : 1混合，通过显微注射方式注射入单细胞时期（出生后半小时内）的斑马鱼鱼卵中，液滴体积大小大约为0.5 nL。显微注射后，更换新鲜的胚胎培养液。并且待胚胎发育至原肠胚时期，用吸管吸走死亡的胚胎，将存活的胚胎再次更换新鲜的胚胎培养液。

3.4 Cas9靶位点效率的检测

采用T7 核酸内切酶 I酶切法检测Cas9靶位点的效率，T7 核酸内切酶 I 可以识别并切割不完全配对 DNA、十字型结构 DNA、Holliday 结构或交叉 DNA、异源双链DNA 或者以更慢的速度切割或切刻双链 DNA，因此常用于突变体的检测。具体如下：

取20颗大约24 hpf的小鱼胚胎分别放置于96孔PCR板中，并且取4颗AB野生型胚胎作为对照组。吸干胚胎培养液，每孔加入20 uL的组织裂解液，样品置于95 ℃水浴锅内裂解30分钟，在振荡器上震碎组织，然后加入等体积的中和液，离心，取上清液作为PCR模板。PCR反应条件如下：

扩增PCR产物利用DNA琼脂糖凝胶电泳检测产物的特异性，将剩余的PCR产物置于98 ℃水浴锅中水浴10分钟（充分打开DNA的二级结构），使其缓慢将至室温，然后进行T7 核酸内切酶 I酶切反应，酶切体系如下：

10 X NEB Buffer 2.1： 1 uL

PCR 产物： 4uL

T7E1酶:0.2 uL

ddH2O：up to 10 uL

37 ℃孵育2小时，电泳，确定条带是否被切开，其中前20孔样品是打了Cas9的实验组，后四个样品为AB对照组。

npsn-exon5-Cas9的PCR产物大小为435 bp，对照组未被切开，进一步说明了在此片段中不存在SNP，而实验组有部分DNA被切成220 bp左右的片段，这说明Cas9 mRNA在靶点处进行了切割，并且产生了突变，并且根据DNA电泳条带的亮度估测此位点的突变效率大约70 %（如图3所示）。

npsn-exon6-Cas9的PCR产物大小为267 bp，对照组未被切开，进一步说明了在此片段中不存在SNP，而实验组有部分DNA被切成150 bp和120 bp的DNA片段，这说明Cas9 mRNA在靶点处进行了切割，并且产生了突变，并且根据DNA电泳条带的亮度估测此位点的突变效率大约50 %（如图4所示）。

图3. npsn-exon5-cas9靶位点效率检测结果

图4. npsn-exon6-cas9靶位点效率检测结果

4. 斑马鱼组织DNA的粗提。

1）将50 X的组织裂解液稀释成1 X的工作液（吸取200 uL 50 X组织裂解液，加入去离子水稀释到10 mL溶液）；将50 X的中和液稀释成1 X的工作液（吸取200 uL 50 X中和液，加入去离子水稀释到10 mL溶液）

2）用吸管吸取斑马鱼胚胎于EP管中，并且用小量程的枪小心吸走多余液体，加入20 uL组织裂解液；

3）将EP管放入95 ℃水浴锅内裂解30分钟；

4）震荡EP管，使组织充分裂解；

5）向EP管中加入相同体积的中和液，震荡混匀并且离心；

6）吸取上清液即可作为PCR反应的模板。

5．npsn缺陷斑马鱼模型构建结果检测

我们设计Cas9靶点在npsn的exon5和exon6上，其中npsn-exon5-Cas9靶点获得（-7，+0）突变体（称为npsnsmu5）（如图5 A所示），在npsn-exon6-Cas9靶点获得（-0，+1）突变体（称为npsnsmu6）（如图5 B所示）。npsnsmu5和npsnsmu6的纯合突变体形态正常，能够存活至成年，并且正常的进行繁殖。

6．突变体中npsn mRNA表达变化检测

为了检测突变体中npsn mRNA的表达是否发生改变，我们利用npsn的整体原位杂交技术检测npsnsmu5突变体中npsn mRNA的表达。结果显示，在npsnsmu5突变体中，npsn信号点几乎检测不到（如图6 A所示），在npsnsmu6突变体中同样出现npsn信号点的缺失。为了检测npsnsmu5突变体中npsn是发生了部分降解还是全面降解，我们在突变位点的前面、后面以及包含突变点处分别设计qPCR的引物，经qRT-PCR检测发现，npsnsmu5中npsn的表达都下降到原来的5 %左右（如图6 B所示），这说明npsnsmu5突变体中npsn mRNA发生了全面降解，这种降解可能是由于无义突变介导mRNA降解（nonsense-mediated decay, NMD）引起的。

图6. npsnsmu5突变体中npsn mRNA发生降解。

A. 3 dpf npsnsmu5突变体和同胞的npsn整体原位杂交。B. qRT-PCR检测npsnsmu5突变体和同胞中npsn表达量的变化。

使用新霉素选择盒替换目的基因5'非翻译区的300个核苷酸的区域，全部外显子1和部分外显子2。将正确靶向的129个ES细胞注射入C57BL / 6J胚泡。