小鼠镇咳模型

1. 该模型鉴定和评价的技术方法和指标体系，符合溃疡性结肠炎的病理特点，尤其与溃疡性结肠炎反复发作、迁延不愈的临床特点高度相似。

（1） 疾病活动指数

（2） 结肠指数

（3） 结肠组织大体评分

（4） HE 染色病理观察

（5） MPO 酶活性检测

2. 与国内外现有模型的异同

现有的溃疡性结肠炎的造模方法有单一化学法刺激、免疫法、免疫复合法、基因修饰法。虽然现在建造UC动物模型的方法多种多样，但是依旧存在着或多或少的缺陷。理想模型要简单易操作，同时尽可能全面、准确的模拟人类UC的病理生理学特点和表现，既要与自发的炎症诱因相近，又要符合肠道炎症进展、组织损伤进展等，同时模型病变尽量维持较长时间，能尽量反映慢性病变的过程和特点，以满足实验的需求。而目前尚缺乏能满足这些要求的模型，且已有模型以急性损伤模型为主。故亟待寻找更好的，具有良好重复性、稳定性，并且操作简单的动物模型，从而为研究UC发病机制、研发治疗新药物提供良好的基础。

3. 本研究的主要创新点或技术关键

3.1 创新点

本模型采用诱导剂联用的方法，建立慢性、炎症维持时间长且病程稳定的小鼠慢性 UC 造模方法。该模型改进了传统溃疡性结肠炎模型的病程短、稳定性差、模型指标缺少特异性等问题，更大程度的模拟了临床慢性溃疡性结肠炎病理指标。

3.2 关键技术

采用噁唑酮和2,4,6-三硝基苯磺酸两种诱导剂联用、致敏与感染相结合的方法，建立了新慢性、炎症维持时间长且病程稳定的小鼠慢性 UC 模型方法。

4. 可行性分析

4.1 前期摸索研究充分，通过阅读大量中外文献，较充分的了解溃疡性结肠炎疾病以及模型建立过程中的问题。

4.2 实验单位具备动物饲养许可证以及较先进的实验器材和检测设备。

4.3 通过阅读大量中外文献和走访调研，噁唑酮和三硝基苯磺酸在临床上应用广泛，效果明显，具有可行性。

本实验采用昆明种6-8周龄的健康成年小鼠，体重均在33±2g，SPF级。饲料垫料均为高压灭菌产品，购自北京斯贝福生物科技股份有限公司，动物用水为实验室制UP水经过除菌处理。饲养及实验操作均于具有检验合格资质的SPF级屏障动物室内进行，并且实验动物以完整的包装直接进入屏障实验室，观察室适应7天后无异常情况，方可进行实验。所有实验中小鼠均引颈处死，尽量减少动物手术创伤程度及失血量。实验过程中动物操作均符合动物伦理学规范，对环境和生态影响等符合国家相关法律规定。

1、模型评价体系

（1）疾病活动指数（disease activity index，DAI）：自造模后的第一日起，每天观察并记录大鼠的体质量、粪便性状及隐血状况并分别对其进行评分，求得 DAI 值。质量降低百分比为 1% 以下记为 0 分；降低百分比为 1% 到 5% 分以内记为 1 分；降低百分比为 5% 到 10% 以内记为 2 分；降低 10% 到 15% 以内记为 3 分；降低 15% 以上记为 4 分。粪便干燥坚硬记为1 分；松散不黏肛周记为 2 分；稀便记为 3 分；水样泻记为 4 分。隐血弱阳性记为 1 分，阳性记为 2 分，强阳性记为 3 分，肉眼血便记为 4 分。三者得分求其平均值，即为 DAI 值。

（2）结肠指数（colonindex，CI）：造模周期结束后将小鼠颈椎脱臼处死，立即打开腹腔，分离全段结肠，并沿肠系膜纵轴剪开，分离出内容物，用生理盐水冲洗两次，滤纸吸干，准确称取结肠湿质量。结肠指数即结肠湿质量与体质量的比值。 CI=m/M×100%（m：结肠质量；M：小鼠体质量）

（3）结肠组织大体评分（colonmacroscopic damage index，CMDI）：模型诱导结束后，小鼠颈椎脱臼处死，打开腹腔从肛门向上的一段结肠，沿肠系膜纵轴剪开，冰生理盐水冲洗干净，置于滤纸上，肠黏膜向上展开，观察结肠大体形态、结肠黏膜损伤情况，大体形态损伤评分参照 Luketal标准进行：0分：结肠无损伤；1分：结肠轻度水肿但没有溃疡；2分：充血而且肠黏膜粗糙呈颗粒状；3分：结肠黏膜溃疡形成，直径约 0~1 cm；4分：结肠黏膜溃疡形成，直径约1~2 cm，但肠管与外周脏器无黏连；5分：溃疡直径1~2 cm，肠管增厚，与周围脏器黏连严重。

（4）免疫组化染色检测IL-4、TNF-α 表达水平：截取1.0cm结肠组织较严重部位立即放入4%多聚甲醛中浸泡24h以上，脱水、透明、修整组织快，浸蜡2h，石蜡包埋。取石蜡组织块，石蜡切片之后按照免疫组化染色步骤对石蜡切片进行目标因子染色，观察并比较阳性细胞表达水平情况。

2、实验结果

2.1小鼠一般情况及结肠大体形态

2.1.1 小鼠一般情况

各组小鼠在致敏期间，进食均正常，精神活跃，毛色光亮，大便正常，呈棕色或棕褐色。在模型诱导期间小鼠均表现出不同程度的稀便，脓血便，体质量大幅度下降，精神萎靡不振，毛色暗淡。模型诱导成功之后，小鼠仍毛色暗淡，有不同程度稀便，甚至便中带血，偶有小鼠精神仍欠佳，但总体状态逐渐好转。

2.1.2 小鼠结肠大体形态

正常组小鼠结肠无任何充血、水肿及溃疡发生。模型组小鼠结肠均呈不同程度充血、水肿及溃疡，并且随着时间延长，小鼠的结肠仍然存在不同程度的损伤。

2.2 疾病活动指数（DAI）评分

按照DAI评分表对各组小鼠进行评分，经统计分析，四周的模型组DAI评分高于正常组小鼠，差异具有统计学意义。（见表2）。

2.3 结肠指数（CI）评分

与N组CI值相比，M组CI评分均高于N组，其中除二、三、四M组小鼠CI评分与N组相比，差异具有统计学意义。（见表2）。

2.4 结肠组织损伤大体评分（CMDI）

参照小鼠结肠病变肉眼评分标准对小鼠结肠进行评分，后经统计分析，与N组CMDI值相比，各M组CMDI评分均高于N组，并且差异具有统计学意义。（见表2）。

2.5 免疫组化染色检测IL-4、TNF-α表达水平

通过免疫组化技术对结肠组织切片染色发现，N组结肠组织形态结构均清晰完整。TNF-α 与IL-4在模型中均有较少表达。四组M组结肠组织形态结构紊乱，腺体增多或者丢失，隐窝结构破环，黏膜下层均有大量IL-4及TNF-α阳性细胞表达。在显微镜10*40倍视野下随机选取5个视野进行拍照，分别计算阳性细胞率，经统计分析，差异有统计学意义。

Fig1 the immunohistochemical expression level of IL-4 and TNF-α in 4 weeks of colonic tissue in mice A: normal group；B：M1 model group；C：M2 model group；D：M3 model group；E：M4 model group；F：the gross morphology of the colon after two months 1：the immunohistochemical expression of IL-4； 2：the immunohistochemical expression of TNF-α（10*40）

1 实验材料

1.1 实验动物

健康雄性昆明小鼠，6~9周龄，体质量均在30 g左右，SPF级，购自北京斯贝福生物科技股份有限公司。

1.2 实验环境

饲养及实验均于SPF级屏障动物室内进行。

1.3 实验试剂

噁唑酮（oxazolone，OXZ）、2，4，6-三硝基苯磺酸（2，4，6-trinitrobenzene

sulfonic acid，TNBS），均购自Sigma公司；白细胞介素-4（interleukin-4，IL-4）、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）抗体，均购自武汉博士德生物工程有限公司。

1.4 检测仪器

HITACHI UV 9100型紫外可见分光光度计，日本Hitachi Limited公司；Tacan Safire2多功酶标仪，意大利Tecan公司；ASP-200全自动组织脱水机，德国Leica公司；LeicaRM2245轮转式切片机，德国Leica公司；WG-136电热恒温鼓风干燥箱，天津市泰斯特仪器有限公司；OLYMPUS-BH-2显微镜，日本OLYMPUS株式会社；Waters 600液相色谱仪，Empower化学项目合作单位，2996 DAD检测器，美国waters公司。

2实验操作规程

人流线路：工作人员进入第一更衣室→脱去个人外衣（饰品）放入衣柜→脱去蓝色拖鞋后(→淋浴室)进入第二更衣室→穿上拖鞋→手消毒（75%的酒精消毒）→按操作规范穿上无菌连体衣，戴上一次性无菌口罩、手套→进入缓冲间→风淋→进入清洁进入饲养室或检疫室→所有工作结束后→进入污物走廊、脱掉红色拖鞋→进入缓冲间→穿上蓝色拖鞋，进入洗刷、消毒区域，走廊→进入洁净区域工作→进入饲养室或检疫室→所有工作结束后→进入污物走廊、脱掉红色拖鞋→进入缓冲间→穿上蓝色拖鞋，进入洗刷、消毒区域，取掉手套、口罩、连体衣，分别放入指定的回收桶中→进入第一更衣室，穿上个人衣（饰）→出屏障系统。

物流线路：物品→高压蒸汽灭菌器或传递窗或渡槽→消毒传递间→清洁准备室→清洁走廊→饲养室或动物实验室→污物经包装处理→（后室缓冲间）→次清洁走廊→气闸（缓冲间）→清洗消毒室→外部区域。

动物流线路：外来SPF级实验动物→传递窗→消毒传递间→清洁准备室→清洁走廊→饲养室或动物实验室→生产繁殖或实验处理后→（后室缓冲间）→次清洁走廊→气闸（缓冲间）→清洗消毒室→外部区域。

3 实验方法

选取24只健康成年昆明小鼠，6~8周龄，体质量30g左右，随机分为两组，正常对照组（N组，n=12）和模型组（M组，n=12）。模型组小鼠腹部剃毛（2 cm×2 cm），模型组第1~2天腹部涂抹2.4%的噁唑酮（溶于无水乙醇）0.2ml进行过敏反应实验，第5天禁食不禁水24h，第6天用长度约8cm的一次性注射胶管表面涂抹液体石蜡，灌肠给予0.4%噁唑酮（40%的乙醇溶解）0.1ml，第7天灌肠给予0.3%的三硝基苯磺酸（40%的乙醇溶解）0.1ml。缓慢将胶管拔出，捏住肛门，倒立小鼠两分钟防止液体流出。7d之后的两种灌肠剂具体灌肠顺序、剂量及溶剂如Fig.1和Tab.1。

P1~P4：the four induced period of the model；O：OXZ；T：TNBS.Fig.1 The induced cycle diagram of the chronic ulcerative colitis model

Tab.1 The induced dose of chronic ulcerative colitis model induced by OXZ and TNBS

Note：P1~P4：the four induced period of the model.

1. 研究目的及意义

本实验动物造模方法采用噁唑酮（oxazolone, OXZ）、2,4,6-三硝基苯磺酸（2,4,6-trinitrobenzene sulfonic acid, TNBS）序贯给药灌肠，诱导制备小鼠迁延性溃疡性结肠炎模型，区别于单用噁唑酮或2,4,6-三硝基苯磺酸等化学药品造成的急性模型，症状和病理变化仅维持3-5天，而本方法可维持1-2个月，大大的延长了模型的持续时间，同时也提高了造模的稳定性和所模拟疾病特征性病变的持久性，更符合临床溃疡性结肠炎慢性迁延、反复发作的特征，对开展溃疡性结肠炎病因、病机和治疗药物的相关动物实验研究具有重要意义。

2. 溃疡性结肠炎动物模型的国内外研究进展

溃疡性结肠炎（ulcerative colitis, UC）又称慢性非特异溃疡性结肠炎，与克罗恩病同属于炎症性肠病（inflammatory bowel disease, IBD）[1-2]，其病因及发病机制至今尚未明确，目前国内外研究主要集中于免疫、遗传、环境及感染等因素，患者临床以粘液、脓血便等消化系统的症状为主，病情反复发作，迁延不愈，严重影响着患者的生活质量，甚至可能导致结肠癌[3]。UC的显微镜下病理特征主要为：隐窝结构异常，上皮细胞异常以及炎症浸润。黏膜炎症弥漫性分布，发病时主要临床表现为腹痛、腹泻、黏液脓血便、里急后重，并出现血沉、中性粒细胞及嗜酸性粒细胞的增多[4]。人类溃疡形成是个缓慢的过程，由于其难愈性、易复发性的特点而成为现代难治性疾病之一。目前关于该疾病的实验室研究模型尚不成熟，且多为急性损伤和病理模拟，缺乏良好的慢性长期的动物模型，无法准确的反映人类临床UC慢性迁延、反复发作的特点[5]。建立UC动物模型实验动物的选择很广泛，大鼠、小鼠、兔等多种实验动物都可，但方法各不相同。目前存在的造模方法有如下几种：

2.1 化学法

2.1.1 乙酸刺激

杨永刚[6]等人采用乙酸灌肠成功建立溃疡性结肠炎模型，张忠[7]用经肛门注入0.5 g/L肥皂水0.15 mL, 约30 min后用2g/L戊巴比妥钠经腹腔麻醉，插入直径3 mm的聚乙烯纤维导管至小鼠直肠内深度约为1~2 cm，注入8%乙酸溶液0.15 mL的方法，结果乙酸组结肠黏膜上皮细胞萎缩、坏死、脱落，成肠壁变薄，皱襞消失，黏膜下淋巴细胞增生并有淋巴滤泡形成。张晓峰[8]研究发现乙酸诱导UC动物模型的作用机理与乙酸直接刺激使血管通透性增加，激肽激活，溶解纤维蛋白活性增加以及凝血机制障碍有关。乙酸诱导UC模型制作方法简单，成本低，短期内可使小鼠出现UC明显的症状及典型病理变化，是目前实验性UC模型中应用最广泛的模型之一，适合于临床研究UC的发病机制以及新药的研制开发。但由于乙酸直接刺激造成结肠黏膜和血管的损伤，与临床致病因素有较大差异，且最初黏膜损伤的非特异性炎症呈现急性过程，不能表现人类UC所具有的慢性，复发的特点[9]。

2.1.2 DSS法

葡聚糖硫酸钠 (dextran sulphate sodium,DSS) 是一种肝素样硫酸多糖体，1958 年Ohkusa[10]最早利用仓鼠建立，闫曙光[11]采用2%葡聚糖硫酸钠口服2周建立溃疡性结肠炎小鼠模型，Trivedi [12]通过给Swiss小鼠连续7d自由饮用3.0%DSS水溶液，之后连续14d给予普通饮水，最后再连续7d给予3.0%DSS水溶液建立DSS的慢性UC模型。但是DSS诱导的溃疡模型个体差异比较明显，且为短期急性模型，不适宜研究慢性UC引发的结肠癌相关问题。

2.2 复合法

2.2.1 恶唑酮模型(oxazolone,OXZ)+乙醇

恶唑酮是一种半抗原物质[13]，其诱导UC模型先致敏然后进行灌肠给药，用恶唑酮溶液对小鼠灌肠,小鼠5d后即可出现肠道炎症[14]，结肠肉眼可见黏膜充血水肿, 糜烂溃疡, 镜下见结肠黏膜溃疡。7d左右病情好转，10d左右基本痊愈。利用恶唑酮建立溃疡性结肠炎模型，速度较快，重复性好且制作简单，但是疾病维持时间相对较短，小鼠模型有自愈倾向，缺少慢性过程，对于慢性复发性溃疡性结肠炎的模拟度不高。

2.2.2 三硝基苯磺酸(2,4,6-trinitrobenzenesulfonic acid,TNBS)+乙醇

采用异戊巴比妥麻醉，一定量TNBS缓慢灌肠可以诱导急性肠炎Wistar大鼠模型；15d以后再次给予定量TNBS灌肠可以造成复发性结肠炎，可以造成复发性结肠炎[15-16]，三硝基苯磺酸与乙醇灌肠一次致炎是目前最为常用的溃疡性结肠炎模型建立方法，具有以上其他建模方法所没有的优点。

2.3 免疫复合法

2.3.1 免疫复合物+TNBS+乙醇

谭琰等[17]实验证实，与TNBS+乙醇诱导的结肠炎动物模型相比，增加免疫复合物进行复合诱导的方式更符合T/B淋巴细胞混合作用的要求，而且炎症持续的时间延长了3~4个星期。崔国宁[18]研究免疫复合法建立的大鼠UC模型表现稳定，重复性好，病变持久，发病机制与人类UC相似，是较为理想的模型。康宜兵等[19]研究示免疫复合建立的模型成功率高，重复性好，与人类的UC相似，是较为理想的模型。具体方法：取20只SD大鼠，随机分为模型组和空白组，每组各10只，模型组给予抗原乳化液于大鼠的背部、颈部皮下，第23天灌肠TNBS/50%乙醇，空白组以生理盐水代替，比较各组大鼠的大便性状、体重、便血等，并进行组织学检查。由此可以看出，本法建立大鼠 UC 模型持续的时间长，溃疡的形成，与炎性反应都有体现，符合临床UC的病理要求，但缺点是比较繁琐。

2.3.2 免疫复合物+乙酸

吴玉泓[20]采用局部乙酸刺激替代TNBS+乙醇灌肠，免疫致敏方法与上述相似，同样起到了模拟人类UC慢性活动性的特点，也适宜于观察和评价药效。

2.4 讨论

UC模型最常见的造模方法为化学法、复合法及免疫复合法等，DSS液、TNBS液是化学法中最常用的诱导剂，对造模成功与否所用到的评价指标主要有：疾病活动指数、结肠指数、结肠组织大体评分[21-22]、MPO酶活性检测[23]，以及形态学观察和免疫组化学染色细胞观察[24-25]等。目前对于溃疡性结肠炎动物模型的诱导大部分属于急性病发式炎症，偶有慢性模型诱导的方法，虽然现在建造UC动物模型的方法多种多样，但是依旧存在着或多或少的缺陷，现阶段的UC模型远不能满足科学研究的需要，故寻找更好，更方便，更符合人类溃疡疾病的模型尤为重要。本实验方法[26-27]将OXZ与TNBS联合灌肠给药，按照一定周期诱导小鼠溃疡性结肠炎模型可维持一个月，使UC模型更接近人类UC发病机制及临床症状，通过控制小鼠的性别、体重、健康饲养状况、实验环境与条件等环节，观察小鼠的行为改变情况、免疫组化、炎症因子的表达情况，为进一步研究UC的发病机制，防治方法提供符合临床实际的、标准的、可重复的、可控易行的实验动物模型，为慢性溃疡性结肠炎模型的研究提供了可靠的数据支持和实验依据，是临床UC治疗药物研究的重要基础。

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