过敏性紫癜兔模型

为了研究Npsn在斑马鱼中性粒细胞中的功能，我们运用CRISPER/Cas9技术对斑马鱼npsn进行全基因组敲除，并且获得了一系列npsn基因发生移码突变的突变体斑马鱼，比如在exon5-Cas9靶点获得的（-7，+0）（npsnsmu5）突变体，和在exon6-Cas9靶点处获得的（-0，+1）（npsnsmu6）突变体，并且经预测它们的蛋白结构相对于野生型斑马鱼出现移码突变和提前终止。但是我们通过WISH检测发现在npsnsmu5突变体斑马鱼中，npsn的信号几乎是缺失的，并且qRT-PCR结果也同样证明了在npsnsmu5突变体中npsn的mRNA水平下降到野生型斑马鱼的5%左右，可能是由npsn的无义突变导致了mRNA的全面降解所导致的。但是npsnsmu5纯合突变体胚胎能够正常存活到成年，大小和体型正常，并且是可以正常的产生后代。

为了研究Npsn缺陷是否影响斑马鱼中性粒细胞的发育，我们通过斑马鱼中性粒细胞特异性标记基因mpx和lyz的整体原位杂交，发现npsnsmu5突变体和野生型斑马对比，mpx+和lyz+信号点的数量没有明显差别。苏丹黑染色也同样发现SB+阳性细胞的数量也没有差异。并且进一步在DIC下观察npsnsmu5突变体和野生型斑马鱼中性粒细胞中的颗粒，也未发现明显区别。以上结果表明，Npsn缺陷并不显著影响斑马鱼中性粒细胞的发育和数量。这可能是因为Npsn只是斑马鱼中性粒细胞中的一种酶颗粒，缺失后并不影响中性粒细胞的发育，但是可能影响了中性粒细胞的某些功能。

为了研究Npsn缺陷对斑马鱼中性粒细胞功能的影响，而中性粒细胞的主要功能是参与机体的固有免疫反应，因此我们做了斑马鱼大肠杆菌的侵染实验。我们利用显微注射的方式感染npsnsmu5突变体和野生型斑马鱼胚胎的卵黄囊，通过记录并比较感染后两者的生存率，发现npsnsmu5突变体在感染大肠杆菌后生存率相对于野生型胚胎显著下降，体内残余的菌量明显上升，并且在感染的早期阶段，npsnsmu5突变体中炎性因子的表达水平比野生型明显升高，这说明了中性粒细胞在抵抗细菌感染中存在功能缺陷。为了进一步验证Npsn在中性粒细胞抵抗感染中的作用，我们通过构建斑马鱼Npsn过表达的转基因系Tg(hsp:Myc-npsn)，并且同时感染大肠杆菌，发现Npsn过表达后能显著提高感染后斑马鱼的存活率。这个结果进一步表明，斑马鱼Npsn有助于斑马鱼抵抗细菌感染。

但是Npsn通过哪种方式来帮助中性粒细胞抵抗感染的呢？先前有体外实验证明，鲤鱼的Npsn能够水解纤连蛋白和明胶，而这两种组分又是细胞外基质的重要成分，那么Npsn是否通过影响斑马鱼中性粒细胞的迁移来影响对大肠杆菌的抵抗的呢？为了验证这个观点，我们观察了在感染后4小时时伤口处中性粒细胞的数量，但是比较npsnsmu5突变体和野生型斑马鱼并没有发现明显差异。另外，Npsn作为一种水解酶，它能否能够直接水解和破坏大肠杆菌细胞的完整性，进而影响大肠杆菌在机体内存活的呢？并且Npsn缺陷主要影响斑马鱼清除哪种类型的菌呢？为了验证这些问题，我们也将npsnsmu5突变体斑马鱼和野生型斑马鱼同时感染了其他类型的菌，如革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌和革兰氏阴性菌铜绿假单胞菌等，发现Npsn缺陷后可能增加斑马鱼对革兰氏阴性菌的敏感性。但是Npsn影响斑马鱼中性粒细胞抵抗细菌感染的具体机制，还需要更多的实验来验证。另外npsnsmu5突变体可以作为斑马鱼免疫与炎症反应模型，对研究在感染过程中，中性粒细胞与病原菌的相互关系，以及对研发新的抗菌药物具有重要的指导意义。

动物模型的制备和应用实验必须在具备相应资质的实验室开展。动物模型的制备、应用过程中的监督管理、处置措施、对环境和生态影响等应符合国家相关法律规定。

1．中性粒细胞的形态及生化特征

原始中性粒细胞的发育首先由髓系祖细胞经谱系决定，发育成粒细胞前体细胞，再由粒细胞前体细胞经过增殖，分化和成熟形成有功能的中性粒细胞。在斑马鱼中，区分中性粒细胞可通过以下形态学与细胞学方法[1,2]：（1）成熟的中性粒细胞最显著的形态学特征为含有分叶核以及大量颗粒的细胞质，可以在循环系统以及结缔组织中被很清晰地辨认。（2）还可以通过分子标记来分辨不同成熟时期的中性粒细胞。已经有研究报道的粒细胞特异分子标记有转录因子C/ebp1，粒细胞颗粒中含有的髓过氧化物酶（Mpx）、溶菌酶C（Lyz）等。（3）另外，还可通过检测细胞的激活、趋化、变形运动能力、及吞噬、杀菌作用来辨别。（4）此外中性粒细胞可被苏丹黑B（Sudanblack B，SB）特异性染色，并且可根据染色程度来辨别不同分化过程的中性粒细胞。

2．中性粒细胞与病原菌感染

中性粒细胞是一种具有多形核的白细胞，是人体固有免疫中的重要组成成分，在机体抵抗病原菌感染时起着重要的作用。中性粒细胞在体内含量丰富，大约占人体白细胞总数的40%-75%[3]，并且在机体遭受病原菌感染时，中性粒细胞能够迅速的从血管中迁移到感染部位[4]。当中性粒细胞到达感染处后，主要通过两种方式来抵抗感染，一种是分泌大量的细胞因子和趋化因子，比如IL-1b[5], IL-18[6], LL-37[7] ADDIN EN.CITE ADDIN EN.CITE.DATA 等，这些小分子能够招募和激活更多的中性粒细胞、巨噬细胞和T淋巴细胞到达感染部位，共同抵抗感染。另一方面，中性粒细胞还能够直接吞噬和消化病原菌，这主要依赖于斑马鱼中性粒细胞中含有丰富的颗粒酶。中性粒细胞内含有多种颗粒，这些颗粒富含各种杀菌作用的蛋白，并且在终末分化完成之前各种富含不同组分的颗粒必须组装完成（如图1所示）。中性粒细胞中三种颗粒分别是（1）嗜天青颗粒：又称初级颗粒，在早幼粒细胞中数量最多，颗粒中含有髓过氧化物酶、溶菌酶及较多的水解酶。（2）特异颗粒：又称次级颗粒，其中含有乳铁蛋白、溶菌酶等，颗粒膜上有多种CD抗原和受体。（3）白明胶酶颗粒：含白明胶酶、溶菌酶[8]。这些颗粒主要通过两种方式来杀灭病原菌。一种是氧依赖性杀菌途径，主要通过激活膜结合成分NADPH系统，产生大量的活性氧（Reactive Oxygen Species,ROS）来直接氧化并杀死病原菌[9]；另一种方式是通过氧非依赖性方式来消化破坏病原菌的细胞膜或壁结构的完整性[10,11]，从而通过使病原菌失去渗透压而死亡。但是目前对这些颗粒酶的研究大多数是在体外实验进行的，大部分颗粒酶的体内功能是未知的。因此了解和研究这些颗粒酶的成分以及颗粒酶的功能有助于研发新的抗菌酶。

图1. 中性粒细胞中所含的颗粒酶种类，引用自Borregaard 等[12]。

3．斑马鱼Npsn蛋白的简介

Npsn最早在鲤鱼（Cyprinus carpio）的淋系造血组织中发现，属于虾红素蛋白家族（astacinfamily）的一员，并且具有肽链内切酶活性[13]。虾红素蛋白家族属于金属锌蛋白酶超家族的一员，在蛋白质消化、个体背腹轴确定以及形态发生中起着重要的作用[14]。研究者通过对比鲤鱼的Npsn的蛋白序列与其他物种的同蛋白家族酶的相似性，发现Npsn与medaka的孵化酶有大于50%的序列相似性，但是作者并没有在鲤鱼的孵化液中检测到Npsn的存在，所以作者猜测Npsn可能没有孵化酶的活性。而关于Npsn的另一个研究是在斑马鱼中进行的，作者通过分析斑马鱼造血组织的ESTs序列以及整体原位杂交（Whole-mount In Situ Hybridization, WISH）实验，发现了三个新的特异性表达在斑马鱼血管以及造血组织中的基因，Npsn就是其中的一个[15]。并且作者通过双色原位杂交进一步发现Npsn可能表达在斑马鱼的中性粒细胞中。根据以上前人的研究，我们猜测，Npsn可能是斑马鱼中性粒细胞中的一种颗粒酶，然而 Npsn在中性粒细胞中的作用，以及是否参与到宿主先天免疫至今尚未有研究。

4．斑马鱼在作为研究中性粒细胞颗粒酶功能的模式生物中的优越性

近几十年来，斑马鱼逐渐成为一种强大的工具来研究感染类疾病，除了斑马鱼的传统优势外，在研究中性粒细胞和病原菌的相互关系中具有独特的优势。首先，斑马鱼中性粒细胞的发育过程是保守的，都是起源于造血干细胞，通过早幼粒、中幼粒最终发育成为成熟的带有分页核的粒细胞[12]。其次，斑马鱼中成熟的转基因技术可以用荧光蛋白标记中性粒细胞，进而在活体实时观察中性粒细胞对病原菌的响应以及吞噬病原菌的过程[16]。第三，利用微分干涉相差显微镜显微镜（DIC）可以清晰看到中性粒细胞所含的颗粒酶，以及颗粒酶的发育过程。

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