SIV感染恒河猴异常免疫激活模型

艾滋病异常免疫激活动物模型的建立是在感染前就开始样本收集，SIV静脉攻毒后98天开始为期3个月的ART治疗，并在停药后继续观察1个月。除了病毒载量及CD4的持续监测，还检测整个疾病过程中T细胞激活情况以及细胞因子的变化。通过疾病控制阶段与病毒阴性阶段，我们发现ART后免疫状态恢复，但一些细胞因子和免疫细胞仍处于高水平。尽管，停药后的病毒反弹阶段和慢性感染阶段都有着高血浆病毒载量。但是，通过对比发现停止ART之后，病毒的免疫激活状态与未治疗阶段有一定差异。特别是，我们的数据显示促炎因子TNF-α，IL-6, IL-1β，IFN-γ的水平显著升高。相较于SE阶段，升高的促炎因子水平可能预示停药后面临更严峻的病毒复制和免疫激活，提示ART持续治疗的重要性。

综上，艾滋病异常免疫激活动物模型研究结果显示，尽管给予ART治疗，但持续的免疫激活仍然存在。血清中的细胞因子和T细胞亚群依然高于正常水平。因此，有效的抗病毒治疗之外，也需要临床的治疗干预抑制机体异常的免疫激活状态。此外，停止给药后，血清中促炎因子水平显著高于慢性感染阶段。提示停药后伴随病毒复制，可能出现更严峻的免疫激活，增加后续治疗的难度，在临床上实验性停药研究中必须进一步评估免疫状态的影响。

1.本实验所用的SIVmac239病毒，在研究所已完成风险评估，具有完整的标准操作程序，全部动物实验活动在ABSL-3实验室中进行。

2.本次申报的新资源“艾滋病异常免疫激活动物模型”在实验过程中严格遵守研究所生物安全规章制度和动物实验规章制度，遵循SIVmac239病毒风险评估和标准操作程序。

3.感染动物实验的开展获得IACUC委员会批准（IACUC号：XJ19005）。

1、病毒载量变化情况：

SIVmac239感染恒河猴后，造成血浆病毒血症。通过给予抗逆转录病毒疗法（ART），将血浆病毒载量抑制在低水平或基本检测不到的水平，停止ART治疗，血浆病毒载量出现反弹。

图1 SIVmac239感染恒河猴模型病毒载量的变化情况

2、CD4绝对数和CD4/CD8的变化情况：

利用流式细胞术，检测感染猴外周血中的CD4+细胞数及CD4/CD8，判断ART治疗后感染猴免疫功能是否有所恢复。结果显示，SIV感染恒河猴在慢性感染阶段（SE）CD4绝对数持续下降；经ART治疗后，血浆病毒载量呈低水平复制，同时CD4细胞数上升，与SI阶段无显著差异,停药之后，CD4细胞数会再次减少。有些个体在慢性感染阶段出现CD4/CD8比值倒置，在进行药物治疗后，随着病毒载量的降低，CD4/CD8倒置现象缓解，停药后可能再次出现CD4/CD8倒置（图2）。

图2 SIVmac239感染恒河猴模型CD4绝对数和CD4/CD8的变化情况

3、病毒DNA变化情况

利用Total DNA检测方法，我们在整个阶段对的病毒DNA进行跟踪，在进行药物治疗后病毒DNA呈下降趋势（图3），但不同于vRNA，并没有降至检测线以下。停药后，SIV DNA显著小于与SE。提示在慢性感染阶段进行ART治疗并不能有效清除病毒的DNA（图3）。

图3 SIVmac239感染恒河猴模型病毒DNA变化情况

4、免疫细胞亚群的变化情况：

为了了解这些免疫细胞亚群在各阶段的水平，我们利用多色流式对PBMC中的免疫相关的T细胞亚群进行分析比较。CD38和HLA-DR是公认的免疫激活标志物。我们发现CD4+CD38+HLA-DR-亚群在ART治疗后，显著高于SI阶段。而其它三个亚群 (CD4+CD38-HLA-DR+, CD4+CD38+HLA-DR+, CD4+CD38-HLA-DR-）经过ART治疗，与未感染阶段水平相当。同样的结果也在CD8+T细胞中发现，CD8+CD38+HLA-DR-亚群比例显著高于SI（图4A, 左图）。上述结果提示，经过ART治疗，CD38+HLA-DR-在T细胞中未能恢复至感染前水平。无论是在CD4细胞还是CD8细胞中，CD38和HLA-DR各亚群在SE和SR阶段水平相似（图4A,右图）。

T细胞亚群在治疗阶段的比例与未感染阶段相当，同样病毒反弹后的T细胞亚群比例与未治疗时无显著差异（图4B）。值得关注的是，尽管经过ART治疗，PD-1+在记忆T细胞亚群中的表达仍处于高水平（图4C, 左图）。此外，结果显示，与CD8+细胞不同，在病毒反弹后，CD4+T细胞中PD-1/TCM显著升高，然而PD-1/TEM却低于SE阶段（图4C,右图）。

图4SIVmac239感染恒河猴模型免疫细胞变化情况的比较

5、细胞因子的变化情况：

为了了解病毒控制期间细胞因子与未感染病时的差异，利用Luminex检测了不同阶段的血清中细胞因子的水平。由于ART介入大部分细胞因子异常激活得到缓解。但仍有一些趋化因子，比如MIP-1β和IL-8显著高于正常值的。此外，结果显示抗炎因子IL-10也高于正常水平（图5, 左图）。

通过SE与SR比较，发现病毒反弹后促炎因子的水平显著升高，包括TNF-α，IL-6，IL-1β以及IFN-γ（图5）。

图5SIVmac239感染恒河猴模型细胞因子变化情况的比较

1、实验材料：SIVmac239病毒；选用体重4-6 kg的SPF恒河猴。实验前体检无异常，必须排除猴免疫缺陷病毒(SIV)、猴逆转录D型病毒(SRV-1，2，5)和猴T淋巴细胞性I型病毒(STLV-1)的感染。猴免疫缺陷病毒（SIV）易感性密切相关的4种基因（Mamu-A*01、Mamu-A*02、Mamu-B*08、Mamu-B*17）筛查结果为阴性。所有感染动物必须在ABSL-3室中进行。

2、 静脉途径SIV恒河猴感染模型制作方法：先用宠物用电推剪推去猴上肢采血部位的猴毛，左手抓住一侧后肢跗关节部位，使后肢皮下静脉怒张。用75%酒精酒精棉球消毒。右手拿吸取病毒液的注射器，针头沿静脉平行方向向向心端刺入血管，见回血后，左手放松，不再紧压，右手缓慢将病毒液推入。完毕后用干棉球压迫止血，将注射器拔出，弃在利器专用桶内。

3、 给药方法：经皮下注射1ml ART药液（TFV+FTC+DTG），每天给药一次，连续给药3个月。

4、 样本收集和检测：按照以下实验方案对动物进行监测和样本采集，检测病毒RNA，CD4绝对数，病毒DNA，免疫细胞以及血清中的细胞因子。

图1实验设计及样本收集

一、疾病概述

艾滋病(Acquired Immunodeficiency Syndrome, AIDS)，是由人免疫缺陷病毒（Human Immunodeficiency Virus, HIV）引起，以全身免疫系统严重损害为特征的传染性疾病，是20世纪危害人类健康和生命最严重的病毒性疾病之一。自美国CDC报道首例艾滋病后，到20世纪80年代中期艾滋病发展成为一个性的流行病。截止2019年底，HIV已感染3800万人，2019年新增感染者170万，2019年因艾滋病死亡69万人。艾滋病在1985年传入我国，2019年，累计报告艾滋病71204例，死亡20999例。艾滋病早已成为关注的公共卫生和社会热点问题，艾滋病的预防与治疗也成为当代生物医学研究的前沿热点之一。

二、模型背景

1、病原）信息

感染毒株为SIVmac239，由美国Aaron Diamond艾滋病研究中心Preston. Marx博士惠赠，本实验室使用中国恒河猴PBMCs扩增制备。它具有高度复制能力、CXCR4受体嗜性，并且能经粘膜传播，这些特性使它在研究HIV感染和发病机制及评价AIDS候选疫苗的功效方面具有重要的现实意义。

2、实验动物背景信息

选用体重4-6 kg的SPF恒河猴。实验前体检无异常，必须排除猴免疫缺陷病毒(SIV)、猴逆转录D型病毒(SRV-1，2，5)和猴T淋巴细胞性I型病毒(STLV-1)的感染。猴免疫缺陷病毒（SIV）易感性密切相关的4种基因（Mamu-A*01、Mamu-A*02、Mamu-B*08、Mamu-B*17）筛查结果为阴性。所有感染动物必须在ABSL-3实验室中进行。

3、研究背景

HIV感染伴随着异常的免疫激活，导致HIV感染者免疫功能障碍，推动了疾病进展。这种异常的免疫激活也是导致非艾滋病定义性疾病，包括心血管疾病神经认知能力下降以及恶性肿瘤的主要原因。

抗逆转录病毒疗法的干预能有效抑制病毒复制至检测不到的水平，恢复免疫系统的功能并降低免疫激活。然而与未感染者相比，T细胞表面仍有过表达的活化标记物，异常高水平的炎症和免疫激活持续存在。研究表明，ART降低免疫激活的效率决定了ART有效重建免疫系统的潜力，进而影响疾病的进展。因此，研究病毒控制期间免疫细胞及免疫活化分子表达的改变, 并将其与未感染阶段的对比，对于了解ART缓解免疫激活的疗效，研究病毒抑制期间的异常免疫激活与疾病进展之间的关系具有重要意义。此外，对病毒反弹后免疫激活水平的研究，将帮助我们评估停药后的风险有重要价值。但是, 由于伦理限制以及临床上很难获得病人感染前和早期感染阶段的样本，目前国内外缺乏病毒感染以及ART治疗整个病程的持续追踪报道。艾滋病异常免疫激活动物模型可以帮助我们检测整个过程的免疫激活情况。