CTLA4敲除小鼠模型

更新时间：2024-11-24 来源：健明迪检测

健明迪检测提供的CTLA4敲除小鼠模型，讨论与结论为了研究Npsn在斑马鱼中性粒细胞中的功能，我们运用CRISPER/Cas9技术对斑马鱼npsn进行全基因组敲除，具有CMA，CNAS认证资质。

讨论与结论

为了研究Npsn在斑马鱼中性粒细胞中的功能，我们运用CRISPER/Cas9技术对斑马鱼npsn进行全基因组敲除，并且获得了一系列npsn基因发生移码突变的突变体斑马鱼，比如在exon5-Cas9靶点获得的（-7，+0）（npsnsmu5）突变体，和在exon6-Cas9靶点处获得的（-0，+1）（npsnsmu6）突变体，并且经预测它们的蛋白结构相对于野生型斑马鱼出现移码突变和提前终止。但是我们通过WISH检测发现在npsnsmu5突变体斑马鱼中，npsn的信号几乎是缺失的，并且qRT-PCR结果也同样证明了在npsnsmu5突变体中npsn的mRNA水平下降到野生型斑马鱼的5%左右，可能是由npsn的无义突变导致了mRNA的全面降解所导致的。但是npsnsmu5纯合突变体胚胎能够正常存活到成年，大小和体型正常，并且是可以正常的产生后代。

为了研究Npsn缺陷是否影响斑马鱼中性粒细胞的发育，我们通过斑马鱼中性粒细胞特异性标记基因mpx和lyz的整体原位杂交，发现npsnsmu5突变体和野生型斑马对比，mpx+和lyz+信号点的数量没有明显差别。苏丹黑染色也同样发现SB+阳性细胞的数量也没有差异。并且进一步在DIC下观察npsnsmu5突变体和野生型斑马鱼中性粒细胞中的颗粒，也未发现明显区别。以上结果表明，Npsn缺陷并不显著影响斑马鱼中性粒细胞的发育和数量。这可能是因为Npsn只是斑马鱼中性粒细胞中的一种酶颗粒，缺失后并不影响中性粒细胞的发育，但是可能影响了中性粒细胞的某些功能。

为了研究Npsn缺陷对斑马鱼中性粒细胞功能的影响，而中性粒细胞的主要功能是参与机体的固有免疫反应，因此我们做了斑马鱼大肠杆菌的侵染实验。我们利用显微注射的方式感染npsnsmu5突变体和野生型斑马鱼胚胎的卵黄囊，通过记录并比较感染后两者的生存率，发现npsnsmu5突变体在感染大肠杆菌后生存率相对于野生型胚胎显著下降，体内残余的菌量明显上升，并且在感染的早期阶段，npsnsmu5突变体中炎性因子的表达水平比野生型明显升高，这说明了中性粒细胞在抵抗细菌感染中存在功能缺陷。为了进一步验证Npsn在中性粒细胞抵抗感染中的作用，我们通过构建斑马鱼Npsn过表达的转基因系Tg(hsp:Myc-npsn)，并且同时感染大肠杆菌，发现Npsn过表达后能显著提高感染后斑马鱼的存活率。这个结果进一步表明，斑马鱼Npsn有助于斑马鱼抵抗细菌感染。

但是Npsn通过哪种方式来帮助中性粒细胞抵抗感染的呢？先前有体外实验证明，鲤鱼的Npsn能够水解纤连蛋白和明胶，而这两种组分又是细胞外基质的重要成分，那么Npsn是否通过影响斑马鱼中性粒细胞的迁移来影响对大肠杆菌的抵抗的呢？为了验证这个观点，我们观察了在感染后4小时时伤口处中性粒细胞的数量，但是比较npsnsmu5突变体和野生型斑马鱼并没有发现明显差异。另外，Npsn作为一种水解酶，它能否能够直接水解和破坏大肠杆菌细胞的完整性，进而影响大肠杆菌在机体内存活的呢？并且Npsn缺陷主要影响斑马鱼清除哪种类型的菌呢？为了验证这些问题，我们也将npsnsmu5突变体斑马鱼和野生型斑马鱼同时感染了其他类型的菌，如革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌和革兰氏阴性菌铜绿假单胞菌等，发现Npsn缺陷后可能增加斑马鱼对革兰氏阴性菌的敏感性。但是Npsn影响斑马鱼中性粒细胞抵抗细菌感染的具体机制，还需要更多的实验来验证。另外npsnsmu5突变体可以作为斑马鱼免疫与炎症反应模型，对研究在感染过程中，中性粒细胞与病原菌的相互关系，以及对研发新的抗菌药物具有重要的指导意义。

评价验证

4.1CTLA4敲除小鼠模型的建立

将F0代小鼠与C57小鼠进行杂交，获得杂合子CTLA4 +/-,将杂合子互交并将子代进行基因型鉴定（图2），得到纯合敲除小鼠CTLA4 -/-。

图2 PCR鉴定子代小鼠基因型

注：使用PCR鉴定子代小鼠基因型，突变可传代。M：Marker（TaKaRa，DL2000）；H: 水。-/-：CTLA4基因敲除纯合子小鼠；+/-：CTLA4基因敲除杂合子小鼠；+/+：野生型小鼠。

4.2CTLA4敲除小鼠生存率及体重变化

早有研究表明，CTLA4基因敲除小鼠会在出生后1月内，由于严重的自身免疫疾病死亡。我们统计了小鼠出生后的生存率及体重变化，CTLA4基因敲除小鼠在出生后3-5周内死亡（图3a）。CTLA4基因敲除小鼠在出生后2周时体重与野生型小鼠相差不多，但在3-4周时体重明显轻于野生型小鼠（图3b），体型也更小（图3c）。

图3 CTLA4基因敲除小鼠生存率及体重变化

注：a：CTLA4基因敲除及同窝野生型小鼠出生后8周内的生存率，CTLA4基因敲除小鼠在出生后3-5周内死亡（n=8）。b: CTLA4基因敲除及同窝野生型小鼠出生4周内的体重变化，CTLA4基因敲除小鼠在出生2周后体重增长缓慢（n=6）。c：CTLA4基因敲除及同窝野生型小鼠体型对比。

4.3CTLA4敲除小鼠组织中蛋白表达

为了鉴定转基因小鼠是否在蛋白水平发生CTLA4敲除，取1-2月龄小鼠脾、肺进行Western Blot，分别使用种属反应性为小鼠、大鼠和人的CTLA4抗体检测蛋白表达（图4）。

图4CTLA4在敲除小鼠中的蛋白及mRNA表达

注：+/+：野生型小鼠；-/-：CTLA4基因敲除纯合子小鼠。

4.4敲除CTLA4基因可导致自身免疫疾病

文献报道，CTLA4基因敲除小鼠会由于严重的自身免疫疾病，在出生后3-4周内死亡，这与我们观察到的结果相似。HE染色结果显示，CTLA4敲除小鼠表现出淋巴样细胞向非淋巴组织（如心脏、肝脏）的浸润（图5b，d）。

图5组织中淋巴细胞浸润

注：在CTLA4-/-小鼠中，淋巴细胞广泛浸润到非淋巴组织中（b, d），图中显示的是心脏（a，b）和肝（c，d）的组织切片HE染色。比例尺=100μm。

制备方法

3.1.4 模型构建流程

利用CRISPR /Cas9 技术，建立CTLA4基因敲除小鼠模型，利用PCR、RT-PCR和Western Blot 的方法进行鉴定及分析。

3.1.5 CTLA4敲除小鼠的建立

3.1.5.1 CTLA4敲除小鼠模型的建立

（1）设计方案

一、载体构建

1.sgRNA 载体

载体名称：pUC57-sgRNA expression vector

Addgene ID: 51132

根据基因信息选择靶点，合成sgRNA（上海英潍捷基）

targeting site 1:

gggttcaaacacatctcaagg

m-ctla4-gRNA up1 5’TAGGgggttcaaacacatctca

m-ctla4-gRNA down1 5’aaacTGAGATGTGTTTGAACCC

targeting site 2:

gagacttctggaacatggaGg

m-ctla4-gRNA up2 5’TAGGgagacttctggaacatgg

m-ctla4-gRNA down2 5’aaacCCATGTTCCAGAAGTCTC

合成的sgRNA单链通过退火复性结合成小片段，插入BSAⅠ线性化的载体

sgRNA插入位点示意图

图1CTLA4敲除小鼠模型构建设计方案

构建完成的sgRNA载体通过体外转录成为可注射的sgRNA。（体外转录用试剂盒：Ambion Am1354）

2，CAS9 载体

载体名称：pST1374-NLS-flag-linker-Cas9

Addgene ID: 44758

载体通过体外转录成为可注射的Cas9-RNA（体外转录用试剂盒：Ambion Am1345）

显微注射：

1、超数排卵：15只3-4周龄c57雌鼠注射激素进行超排。

2、受精卵注射：取约150枚受精卵进行注射。

3、雄鼠结扎：制作30只8周龄输精管结扎的c57雄鼠。

4、受体鼠制备：8-10周龄ICR雌鼠与结扎的ICR雄鼠交配后选取见栓的雌鼠。

5、胚胎移植：将注射后的受精卵移植到受体鼠输卵管壶腹部（移植一次， 120枚卵，4只受体鼠）。

基因型鉴定：

1、剪尾编号：出生7-10天的乳鼠，剪取脚趾和尾尖进行编号及取材。

2、基因组DNA提取：使用全式金（Transgen）公司的基因组DNA提取试剂盒（EE101-12）提取基因组DNA

3、PCR检测：根据序列信息设计检测引物（上海英潍捷基）

M-CTLA4-KO-S 5’AGAAATTATACTCTCCAAGACTCCACG

M-CTLA4-KO-A 5’CCTTAAGTCCCAGCTGAGATCC

KO：

TM=62℃WT：727bp ko:(见测序分析)

PCR反应体系及扩增程序（TaKaRa RR042A）

反应体系：

l10×LA PCRBufferⅡ(Mg2+ Plus)

l2.0 μl

ldNTP Mixture(2.5 μM)

l1.6 μl

l引物-S（50μM ）

l0.2 μl

l引物-A（50μM ）

l0.2 μl

l模板DNA

l2.0 μl

lLA Taq

l0.2 μl

l补加ddH2O至总体积

l20.0μl

扩增程序：

l95℃

l15 min；

l95℃, 30 s

lTM-2℃, 30 s

l72℃, 2 min 30循环；

l72℃

lmin；

6×loading buffer 终止反应。

用1%的琼脂糖凝胶进行电泳。

4、结果分析：选取PCR检测分子量不同于野生型条带的 (下图中箭头所示)，将PCR产物进行TA克隆，之后用检测引物进行菌液PCR，筛选有插入的克隆测序。

1-23#基因组PCR结果图（TaKaRa marker DL2000）（上游PCR结果）

1-23#基因组PCR结果图（TaKaRa marker DL2000）（KO PCR结果）

5、测序结果：

KO：4#，6#，7#，10#，15# 灰色为缺失部分

4#agaaattatactctccaagactccacgtctccaggtcctcagaggtgactcgaagcttcagtttcaagttgagtacattttccatccatggatttgcttgttttgttcagttttagtttgaatatttgaggtcgtctttacgacgtaacagctaaacccacggcttcctttctcgtaaaaccaaaacaaaaaggctctctgttcaggtgtcctgtgtgtgcactacacatatgtagcacgtaccttggatcaaagctgtctatataaagtccccgagtctgtgtgggttcaaacacatctcaaggcttctggatcctgttgggttttactctgctccctgaggacctcagcacatttgccccccagccatggcttgtcttggactccggaggtacaaagctcaactgcagctgccttctaggacttggccttttgtagccctgctcactcttcttttcatcccagtcttctctgaaggtgagtggagacttctggaacatggaggtggaggaggtgtttttcctacatgggtttcgttttttttttttctttcagaagctgaggacagtgatttatagaaatgccagaagttaaagccaaaccctctactttttggtttaacagcttcctacagacaagttccaagaagaatataggaggtctagcagtagcgaaggagctgagactagccacagcagcttgctgggatctcagctgggacttaagg

6#agaaattatactctccaagactccacgtctccaggtcctcagaggtgactcgaagcttcagtttcaagttgagtacattttccatccatggatttgcttgttttgttcagttttagtttgaatatttgaggtcgtctttacgacgtaacagctaaacccacggcttcctttctcgtaaaaccaaaacaaaaaggctctctgttcaggtgtcctgtgtgtgcactacacatatgtagcacgtaccttggatcaaagctgtctatataaagtccccgagtctgtgtgggttcaaacacatctcaaggcttctggatcctgttgggttttactctgctccctgaggacctcagcacatttgccccccagccatggcttgtcttggactccggaggtacaaagctcaactgcagctgccttctaggacttggccttttgtagccctgctcactcttcttttcatcccagtcttctctgaaggtgagtggagacttctggaacatggaggtggaggaggtgtttttcctacatgggtttcgttttttttttttctttcagaagctgaggacagtgatttatagaaatgccagaagttaaagccaaaccctctactttttggtttaacagcttcctacagacaagttccaagaagaatataggaggtctagcagtagcgaaggagctgagactagccacagcagcttgctgggatctcagctgggacttaagg

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3.1.5.2 动物繁殖和表达图谱分析

获得F0代后，首先通过与野生型C57小鼠进行杂交，进行基因修饰小鼠传代能力分析。之后CTLA4敲除小鼠通过杂合子与杂合子杂交，获得CTLA4敲除小鼠纯合子小鼠，进行蛋白表达分析，并用于后续实验。

3.1.5.3 鼠尾基因组DNA鉴定

在幼崽出生后剪脚趾标记，并剪尾至1.5 mL EP管。然后参照鼠尾直接PCR试剂盒（bimake）说明书按以下程序操作。

1.1. 按小鼠数量配制组织消化液，试剂比例如下：

（单样本）

Protease Plus

2 μL

Buffer L

100 μL

组织消化液现用现配，充分混匀后使用。

1.2. 向每个含有样本的EP管中加入100 μL新鲜组织消化液，55℃水浴/金属浴中消化15 min。组织消化时，务必将组织完全浸没于消化液中。消化完成后，组织外观上仍然完整，但足量的基因组DNA已经释放，不影响后续的PCR实验。

1.3. 将样本置于95℃水浴/金属浴中孵育5 min以灭活消化液中的蛋白酶活性。12000 rpm离心5分钟，取上清作为PCR模板。消化后的上清或连同组织的消化液可于-20℃保存三个月。

2. PCR扩增

2.1. PCR反应体系：

PCR 反应组分

20 μL 反应体系 (μL)

50 μL 反应体系 (μL)

ddH2O

正向引物 (10 μM)

0.5

反向引物 (10 μM)

0.5

模板（消化产物）

2 x M-PCR OPTI™ Mix

注：模板体积可以适当调整。

2.2. PCR反应条件：

温度 (℃)

时间

循环数

5 min

20 sec

30 sec

X min (2kb/min)

5 min

3. 琼脂糖凝胶电泳

试剂2 x M-PCR OPTITM Mix中含有溴酚蓝染料，PCR产物可直接点样进行琼脂糖凝胶电泳。

研究背景

1、造模因素信息

小鼠CTLA4基因位于第一号染色体的1C2区段（Chromosome 1: 60,887,000-60,915,832，ENSMUSG00000026011）

2、实验动物背景信息

c57bl/6小鼠也被称为c57 black 6，1921年被培育出来，属于近交品系。该品系的最主要的两个特点就是品系稳定和易于繁殖。另外c57bl/6小鼠是第一个完成基因组测序的小鼠品系。

3、研究背景

细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4 (cytotoxic T-lymphocyte associated protein 4，CTLA4)（CD152）和CD28是表达在CD4 +和CD8 + T细胞的同源受体，两者共享在抗原呈递细胞表面表达的一对配体，并且在T细胞活化中介导相反的功能。配体与CD28相互作用，介导T细胞与T细胞受体（TCR）信号共刺激。CTLA4最初被发现是一种传递抑制信号，对于终止免疫反应非常重要[1, 2]。T细胞活化受到CTLA4的负面调节，例如与CD28竞争与它们共同的配体B7.1和B7.2的结合[3]。尽管CTLA4调节免疫系统的确切机制仍存在争议，但CTLA4的抑制功能受到广泛认可[4]。所有CTLA4 敲除小鼠在淋巴结和脾脏均显示大量淋巴细胞增殖，随后白细胞对几乎所有组织进行自身免疫攻击，并导致小鼠过早死亡[1, 2, 5]。

[1]Waterhouse P, Penninger JM, Timms E, et al. Lymphoproliferative disorders with early lethality in mice deficient in Ctla-4[J]. Science, 1995, 270(5238): 985-8.

[2]Tivol EA, Borriello F, Schweitzer AN, et al. Loss of CTLA-4 leads to massive lymphoproliferation and fatal multiorgan tissue destruction, revealing a critical negative regulatory role of CTLA-4[J]. Immunity, 1995, 3(5): 541-7.

[3]Sharpe AH, Freeman GJ. The B7-CD28 superfamily[J]. Nature reviews Immunology, 2002, 2(2): 116-26.

[4]Egen JG, Kuhns MS, Allison JP. CTLA-4: new insights into its biological function and use in tumor immunotherapy[J]. Nature immunology, 2002, 3(7): 611-8.

[5]Chambers CA, Sullivan TJ, Allison JP. Lymphoproliferation in CTLA-4-deficient mice is mediated by costimulation-dependent activation of CD4+ T cells[J]. Immunity, 1997, 7(6): 885-95.