小鼠乳头瘤病毒皮肤感染模型

流行病学数据表明，HPV感染与5%人类癌症有关。现有HPV疫苗可有效预防大多数因乳头瘤状病毒感染而引起的癌症，但目前尚无针对HPV感染后引起恶性癌症的治疗方法，因此发展有效抗HPV治疗方法仍是重要的医学挑战。由于乳头瘤病毒感染具有宿主特异性，HPV只感染人，尚不能自然感染其它动物，这就限制了HPV感染动物模型发展及发病机制研究。研究人员通过犬口腔乳头瘤病毒（Canine oral papillomavirus，COPV）、牛乳头瘤病毒（Bovine papillomavirus，BPV）及棉尾兔乳头瘤病毒等进行了乳头瘤病毒引起的癌症致病机制研究及疫苗研发。虽然这些模型已经帮助我们了解这类致癌病毒的感染过程、生命周期和发病机制以及在疫苗评价方面做出了重要贡献，但由于这些动物体积较大并且其生物学、遗传学、免疫学于人类不同以及试剂的有限性等原因限制了对HPV更进一步的研究。2011年印度科学家发现的鼠乳头状病毒可感染实验室小鼠品系，首次提供在小鼠上研究乳头瘤状病毒的机会。

本研究中，NU/NU小鼠尾部感染MmuPV116周后可肉眼观察到明显乳头瘤状病变，增生组织均能检测到MmuPV1 DNA。尾部组织病理HE染色观察可见感染的小鼠尾部鳞状上皮增生；RNAscope技术是在RNA水平利用靶向特异性双Z设计探针检测单链RNA的原位杂交，解决了尚无MmuPV1相应抗体检测及定量的问题。本模型中，MmuPV1感染小鼠尾部皮肤可检测到明显E1^E4转录本信号。同时将MmuPV1感染增生尾部皮肤与未感染小鼠尾部进行转录水平比较分析发现，差异基因主要与皮肤上发育、核糖体合成、嘌呤核苷酸代谢等生物进程有关，并且富集到癌症信号通路、核糖体合成相关信号通路等，说明相关基因与信号通路可能直接或间接参与MmuPV1感染尾部皮肤后病变的发生。

综上所述，MmuPV1感染NU/NU小鼠尾部皮肤增生模型的建立，为HPV感染、致病机制研究以及防治策略等方面提供更多机会。

人乳头瘤病毒在《人间传播的病原微生物名录》中的危害程度属于第三类。但由于该病毒不能感染动物，科研人员使用小鼠乳头瘤病毒建立动物参比模型，用于人乳头瘤病毒感染及致病机制研究。MmuPV1未被收录《人间传播的病原微生物名录》中。MmuPV1和HPV同属于乳多空病毒科乳头瘤病毒属，由于MmuPV1发现时间较短，对其研究较为有限，因此，其许多生物学信息可参考HPV的资料。

小鼠乳头瘤病毒未被收录《人间传播的病原微生物名录》中；但人乳头瘤病毒在《人间传播的病原微生物名录》中的危害程度属于第三类。为保证实验室生物安全，防止该病原对实验动物的感染，本实验室按照生物安全三类病原进行防范。根据《人间传染的病原微生物名录》中对不同类别病原微生物进行实验要求不同生物安全级别实验室的解释，在实验操作涉及小鼠乳头瘤病毒的大量培养、离心、冻干等实验操作以及小鼠乳头瘤病毒感染的动物实验应在BSL-2或ABSL-2实验室进行。对于未经小鼠乳头瘤病毒培养的感染材料的操作应在BSL-2实验室进行。对经有效方法灭活后不含小鼠乳头瘤病毒活病毒材料或无感染性材料的实验操作可在BSL-1实验室进行。

1.NU/NU小鼠尾部感染MmuPV1观察

肉眼观察可见，感染后4周左右部分小鼠尾部皮肤即出现轻微增生，16周后可观察到明显病变（图1）。

图1 MmuPV1感染NU/NU小鼠尾部增生模型

2.NU/NU小鼠尾部感染MmuPV1 DNA检测

MmuPV1感染尾部提取总DNA，利用对MmuPV1 E2基因特异性引物扩增鉴定MmuPV1表达。结果表明， 9只感染MmuPV1的小鼠尾部均建立MmuPV1持续感染，并可检测到MmuPV1 DNA（图2）。

图2感染小鼠尾部MmuPV1 E2基因PCR鉴定

1-9：MmuPV1感染小鼠尾部DNA；10：MmuPV1质粒（阳性对照）；

11：未感染小鼠尾部DNA（阴性对照）；12：水（空白对照）；

M：Trans 2k Plus DNA Marker

3.NU/NU小鼠尾部感染MmuPV1后的病理学变化

用MmuPV1感染NU/NU小鼠尾部，16周后出现明显增生，收集增生部位用10%福尔马林固定，苏木精伊红染色（HE染色）后进行病理分析。组织学观察可见感染的小鼠尾部表面鳞状上皮增生（图3）。因为MmuPV1 E1^E4转录本存在于大多数乳头瘤病毒早期和晚期转录过程，即利用RNAscope原位杂交检测MmuPV1 E1^E4转录本表达，发现尾部增生部位转录本的表达为明显阳性（棕色）（图4A），而阴性探针组未检测到信号（图4B）。

图3MmuPV1感染小鼠尾部病变HE染色分析（100X）

图4 RNAscope原位杂交检测感染小鼠尾部病变MmuPV1 E1^E4转录本

A： RNAscope原位杂交E1^E4转录本检测；B：RNAscope原位杂交阴性探针对照

4.NU/NU小鼠尾部感染MmuPV1转录水平差异表达分析

NU/NU小鼠尾部感染MmuPV1 16周后，尾部增生皮肤（实验组Tail）及尾部正常皮肤（空白对照组Tail C）差异基因表达分析。结果表明，与对照组比，实验组有2653个基因表达上调（红色点），2306个基因表达下调（绿色点），蓝色点表示未发生显著变化的基因，其中横坐标表示基因表达的倍数变化（log2FoldChange），其中绝对值越大表明，与对照组相比，实验组表达变化倍数越大；纵坐标表示表达差异的显著水平，Y轴1.3附近虚线对于Pvalue＝0.05（图5A）。根据GO富集分析（图5B），差异基因主要与皮肤上发育、核糖体合成、嘌呤核苷酸代谢等生物进程有关；将差异基因进行KEGG功能富集到癌症信号通路、核糖体合成相关信号通路等，说明其可能直接或间接参与MmuPV1感染尾部皮肤后病变的发生（图5C）。

图5MmuPV1感染小鼠尾部转录水平差异表达

A：差异表达基因火山图；B：GO富集分析结果；C：KEGG通路富集分析结果

1.小鼠尾部MmuPV1感染

三溴乙醇小鼠麻醉，按每公斤体重腹腔注射240mg。待小鼠麻醉后，利用刀片在小鼠尾部反复轻轻刮擦20次左右，取10μl病毒液（6×108 VGE）滴加到刮擦过的尾部。每周观察2次，待尾部病变直径接近1cm时，安乐小鼠并收集肿瘤。部分肿瘤组织置于福尔马林固定液用于组织学研究；部分肿瘤组织置于液氮中速冻，并保存于-80℃进行后续感染和分子研究。

2.小鼠尾部MmuPV1DNA提取

使用分离柱法分离组织DNA。取MmuPV1感染尾部的增生部位，利用DNeasy Blood & Tissue Kit（Qiagen）。提取方法如下：将25mg切成尽量小块置于1.5ml EP管中，加入180μlBuffer ATL及20μl Proteinase K，震荡混匀，56℃孵育1-3h至增生组织完全裂解，孵育期间间断震荡；震荡15s，加入200μl Buffer AL，震荡充分混合，加入200μl无水乙醇，再次充分震荡混匀；混合物转移至DNeasy Mini spin column，6,000×g（8,000rpm）离心1min，弃废液；柱子中加入500μl Buffer AW1，6000×g（8000rpm）离心1min，弃废液；柱子中加入500μl Buffer AW2，20,000×g（14,000rpm）离心3min，弃废液；将珠子置于新的1.5ml或2ml离心管，在柱子的膜上加200μl Buffer AE，室温静置1min，≥6000×g（8000rpm）离心1min。

3.小鼠尾部MmuPV1的PCR检测

将小鼠尾部增生组织置于PBS中，利用匀浆器高速匀浆3min。匀浆液10，000rpm离心3min，将上清液转移到新1.5ml EP管中。配置反应体系，上下游引物分别为对MmuPV1 E2基因，MmuPV1_E2_1（5`-GCC CGA AGA CAA CAC CGC CAC G-3`）和MmuPV1_E2_2（5'-CCT CCG CCT CGT CCC CAA AAA ATG G-3'）。反应条件：95℃ 10min；95℃ 15s；60℃ 60s，68℃ 45s，40个循环；68℃ 10min。

4.小鼠尾部MmuPV1感染组织病理学检测

安乐小鼠，解剖采集尾部增生部位皮肤，进行苏木精-伊红（HE染色）。方法简述：组织块经10%的多聚甲醛固定、脱水透明后，置于熔化的石蜡中进行包埋，进而制作石蜡切片；切片脱蜡后进行HE染色；进一步的脱水透明，封片，显微镜下观察。

5.RNAscope原位杂交

安乐小鼠，解剖采集尾部增生部位皮肤置于10%多聚甲醛固定、脱水透明后，置于熔化的石蜡中进行包埋，进而制作石蜡切片，切片进行后续RNAscope原位杂交，具体实验步骤如下：

（1）载玻片脱蜡：60℃烤片1h，二甲苯脱蜡2次，每次5min，100%酒精2次，每次1min，切片朝上放到吸水纸上，室温静置干燥5min；

（2）双氧水靶标修复：切片滴加约5-8滴RNAscope®双氧水，室温孵育10min，蒸馏水清洗切片3-5次后，将载玻片浸没到煮沸的1×RNAscope®靶标修复液中放置15min，蒸馏水清洗3-5次，100%乙醇中清洗1次，室温静置干燥；

（3）画疏水圈：使用ImmedgeTM疏水笔在样本周围化疏水圈2-4次；

（4）将载玻片置于HybEZTM载玻片架中，滴加5滴RNAscope®蛋白酶plus，放入HybEZTM湿盒，放回40℃杂交炉 30min。蒸馏水洗3次；

（5）探针杂交：载玻片滴加4滴E1^E4探针，再放入湿盒，杂交炉40℃孵育2h，将载玻片浸没于1×清洗缓冲液中，室温，每次2min；

（6）杂交Amp1：载玻片上滴加4滴Amp1，放回湿盒，杂交炉杂交炉40℃孵育30min，将载玻片浸没于1×清洗缓冲液中，室温，每次2min；

（7）杂交Amp2：载玻片上滴加4滴Amp2，放回湿盒，杂交炉杂交炉40℃孵育15min，将载玻片浸没于1×清洗缓冲液中，室温，每次2min；

（8）杂交Amp3：载玻片上滴加4滴Amp3，放回湿盒，杂交炉杂交炉40℃孵育30min，将载玻片浸没于1×清洗缓冲液中，室温，每次2min；

（9）杂交Amp4：载玻片上滴加4滴Amp4，放回湿盒，杂交炉杂交炉40℃孵育15min，将载玻片浸没于1×清洗缓冲液中，室温，每次2min；

（10）杂交Amp5：载玻片上滴加4滴Amp5，放回湿盒，杂交炉杂交炉40℃孵育30min，将载玻片浸没于1×清洗缓冲液中，室温，每次2min；

（11）杂交Amp6：载玻片上滴加4滴Amp6，放回湿盒，杂交炉杂交炉40℃孵育15min，将载玻片浸没于1×清洗缓冲液中，室温，每次2min；

（12）信号检测：弃掉液体后，载玻片上滴加120μl DAB工作液，室温静置10min，去除DAB工作液，蒸馏水洗3-5次；

（13）载玻片复染：载玻片放入苏木精染色液中，室温静置2min，蒸馏水洗3-5次，利用0.02%氨水洗一次，蒸馏水再洗3-5次；

（14）载玻片脱水：载玻片放入70%乙醇，室温静置2min，100%酒精，室温静置2min，100%酒精，室温静置2min，二甲苯溶液，室温静置5min；

（15）封片：载玻片风干后，滴加1滴Cytoseal封片剂，盖上盖玻片，风干载玻片5min。

6.转录组差异分析

TRIzol法提取尾部增生皮肤（实验组）及尾部正常皮肤（空白对照组）样本RNA，通过琼脂糖凝胶电泳分析RNA完整性及是否有DNA污染、Nanodrop进行RNA浓度和纯度检测。送到北京诺禾致源科技股份有限公司测序平台进行RNA测序。通过文库构建并测序获得原始测序序列后进行信息分析流程，主要由两个阶段：a）评估测序数据质量；b）信息挖掘及分析。将实验组与对照组RNA-seq序列进行对比，鉴定分析差异基因表达和聚类分析（包括差异基因数目统计、GO富集分析、KEGG通路富集分析），采用edgeR软件进行表达差异显著性分析。

1.病原学

乳头瘤病毒（Papillomaviruses, PV）为无包膜双链DNA病毒，可感染粘膜和/或皮肤上皮细胞，具有高度宿主特异性。人乳头瘤病毒（human papillomaviruses, HPV）可导致人类宫颈癌、皮肤癌、口腔癌、肛门癌等恶性病变，目前尚无针对HPV感染后病变或引起恶性癌症的治疗方法。由于病毒的宿主特异性，HPV感染人，不能感染其它动物，这限制了病毒感染动物模型的建立。

2011年印度科学家发现小鼠乳头瘤病毒（Mouse papillomavirus type 1, MmuPV1）可感染实验室小鼠品系，首次为乳头瘤状病毒感染小鼠实验模型制备提供机会。与HPV一样，MmuPV1也属于乳多空病毒科乳头瘤病毒属，由闭合环状双链DNA分子组成，其长度为7510bp，含有一条编码链，至少编码7个ORFs。

乳头瘤病毒对热敏感，70℃30分钟可灭活，但在室温干燥环境下3天，病毒活力仍有50%。乙醇、异丙醇、戊二醛、邻苯二甲醛、苯酚等常用消毒剂均无法杀灭病毒。0.55%次氯酸钠和1.2%过氧乙酸可灭活病毒。

2.来源

MmuPV1主要由小鼠自身携带。

3.发病机制

MmuPV1感染免疫健全小鼠品系不会引起相应乳头瘤病，如BALB/c、C57/BL6等；但其感染免疫缺陷小鼠品系时，尤其T细胞缺失小鼠品系可导致乳头瘤状增生甚至癌症，但尚不明确何种T细胞亚群在其中发挥作用。参与乳头瘤病毒致癌作用最重要的两个基因是E6和E7早期基因，与多个靶基因结合后使其功能性失活，从而导致组织器官病变甚至恶性肿瘤。MmuPV1也含有致瘤性的E6和E7基因。

4.流行特征

2011年，印度科学家Ingle A等人首次在T细胞缺陷小鼠NMRI-Foxn1nu/ Foxn1nu裸鼠中分离鉴定得到小鼠乳头瘤病毒MmuPV1，其病变区组织病理学分析显示与PV相关疾病特征一致，即具有PV特异性抗原阳性的空泡细胞乳头状突起。该病毒可向未感染部位横向传播，并可传染其他NMRI-FoxN1nu/FoxN1nu裸鼠，以及诱导免疫健全S/RV/Cri-ba/ba小鼠皮肤病理损伤。多个免疫健全小鼠品系感染小鼠乳头瘤病毒均不会引起乳头瘤病，只有缺失T细胞的小鼠品系对小鼠乳头瘤病毒更易感。目前，尚未见对其流行情况的调查研究。

5.临床表现

MmuPV1感染可引起某些品系小鼠皮肤癌。经紫外线照射的免疫健全或免疫缺陷小鼠品系的皮肤感染MmuPV1后，可产生皮肤疣，甚至癌症，因此，MmuPV1感染小鼠模型可作为HPV相关皮肤疾病和癌症进程的首选模型。HPV有关口腔癌在年轻男性中呈现上升趋势，MmuPV1感染小鼠舌头、舌根和口咽部等可作为研究HPV相关口腔癌的理想模型。HPV可感染生殖生殖器，并且新生儿复发性呼吸道乳头瘤病就是由于HPV感染导致，皮肤感染MmuPV1的小鼠不但可以继发感染皮肤，也可继发感染粘膜组织。这样，MmuPV1感染小鼠模型也有助于伴侣间病毒横向传播及母婴垂直传播研究。

6.培养特性

因为乳头瘤病毒的生命周期依赖于宿主上皮细胞分化，通过擦伤的上皮细胞或粘膜组织感染宿主从而进入宿主基底层细胞。基底层细胞感染后，潜伏乳头瘤病毒导致相关疾病发生。因此，乳头瘤病毒的复制过程依赖于角质细胞的分化过程。由于无法在体外实现上皮细胞的分化，所以现在还不能成功体外培养乳头瘤病毒。MmuPV1可感染T细胞缺失小鼠品系，引起感染部位乳头瘤状病变，可用于病毒制备。部分免疫健全品系也可引起乳头瘤状病变，也可用于病毒制备及感染同种小鼠品系或其它小鼠品系。

模型背景：

1、小鼠乳头瘤病毒信息

2011年分离得到的小鼠乳头状病毒可感染实验室小鼠品系，首次提供可用于乳头瘤状病毒小鼠模型构制备及相关研究。与HPV一样，MmuPV1也是环状双链DNA，其基因组长度为7510bp，至少编码7个开放阅读框（ORFs），基于其在病毒基因组内的保守位置以及与其它乳头瘤病毒长度相当的ORF，分别命名为早期编码区E1、E2、E4、E6和E7及晚期编码区L1和L2。本模型使用小鼠乳头瘤病毒（the mouse papillomavirus, MmuPV1）为宾夕法尼亚州立大学Jiafen Hu教授友情馈赠。

2、实验动物背景信息

SPF级6-8周龄NU/NU nude mouse，雌性购自北京维通利华实验动物技术有限公司。该品系小鼠来源于NIH，名称Crl: NU-Foxn1nu，为无毛、白化背景，因携带Foxn1nu突变，胸腺发育不良，不能产生T细胞。

3、研究背景

人乳头瘤病毒（HPV）持续感染可引起约5%人类癌症，包括宫颈癌、皮肤癌、口腔癌、肛门癌等。现有疫苗可有效预防针对HPV的感染，但目前尚无针对HPV感染后病变或引起恶性肿瘤的有效治疗方法，仍需加强相关领域研究。由于HPV感染具有宿主特异性，只能感染人，尚未建立理想的HPV感染动物模型。在病毒嗜性和宿主免疫情况的背景下，构建了数个HPV参比动物模型，如牛、够、兔等PV感染模型，但高成本和技术限制了研究的进展。2011年分离得到小鼠乳头瘤病毒（MmuPV1）可感染实验室小鼠品系，并引发小鼠恶性肿瘤，是目前唯一可用于乳头瘤小鼠感染模型创制的病毒。MmuPV1感染小鼠模型具有动物体积小，易于操作，试剂盒丰富等诸多优点。因此，MmuPV1感染小鼠模型为乳头瘤病毒感染进一步深入研究提供关键平台。

MmuPV1易感动物为T细胞缺陷的小鼠。感染免疫健全小鼠一般不出现临床症状，但可在感染部位检测到病毒基因组，即使出现乳头瘤状增生，均可在一段时间后，清除病毒，即检测不到病毒基因组。高剂量1×1012 copies MmuPV1感染免疫功能健全的SENCAR小鼠，大部分可在感染部位出现乳头瘤样病变，但高剂量1×1012copies MmuPV1感染野生型C57BL/6则无病变产生。