大鼠母子分离早期离乳应激模型

母子分离加早期离乳，雄性大鼠显示焦虑行为，而雌性大鼠未显示焦虑行为。在非应激状态下（ Y迷宫实验），雌性大鼠空间工作记忆能力下降。在应激状态下（Barnes迷宫实验），雌性和雄性大鼠的空间参考记忆能力均未受损。条件恐惧实验结果显示，雄性大鼠环境相关的恐惧记忆能力增强。电生理实验结果显示，雄性大鼠前额皮层谷氨酸能神经元的兴奋性下降，可能是其焦虑行为的产生机制之一。母子分离加早期离乳对成年大鼠影响的性别差异，还需要进一步研究。

该研究在已报导的小鼠母子分离加早期离乳应激方法基础上，首次制备了大鼠母子分离加早期离乳应激模型，注重了应激因素的累计效应，更接近临床。本模型对于揭示早期生活应激事件和成年后神经精神障碍的关系及分子机制研究具有一定意义。本模型的其他病理生理机制，还有待进一步研究。

本模型不涉及除遗传物质重组对环境生态影响以外的其它安全性问题，本模型小鼠的保存、使用和处理均按照研究所伦理和安全委员会的要求执行，可以确保不产生安全性问题。

1.MSEW雄性大鼠出现焦虑行为。空场实验和高架十字迷宫实验是用于评价大小鼠焦虑行为的实验方法。空场实验中，动物在中央区时间减少或高架十字迷宫实验中，动物在开臂时间和中央区时间减少，闭臂时间增多，均提示动物焦虑行为增强。本实验结果表明（图1），雄性大鼠MSEW模型中央区时间减少。高架十字迷宫实验结果表明（图2），雄性大鼠MSEW模型开臂百分比，向下探头次数均减少。上述实验结果均提示雄性大鼠MSEW模型，而雌性大鼠无上述表现。

图1 MSEW大鼠模型空场实验中央区时间（A）及高架十字迷宫实验开臂时间百分率（OT%）向下探头次数（B）、中央区时间（C）及在闭臂中的时间（D）

2.MSEW雌雄性大鼠联想学习无损伤，但MSEW雄性大鼠环境相关的恐惧记忆增强。条件性恐惧实验是由一个条件刺激（声音、光照）与一个引起强烈恐惧反应的非条件刺激（足底电击）结合而成，当条件刺激与非条件刺激产生联想，生成条件性恐惧记忆，动物表现为僵直时间增长。本实验中，动物在条件恐惧训练箱中适应3 min，对动物进行5个循环的训练，每轮训练包括：接受声音刺激（30s，5000HZ，70dB），声音刺激的最后1 s给予电流刺激（0.65 mA ,1s）。每轮训练间隔30 s。24 h后，将动物放入同一训练箱。无声音刺激，无电击，记录5 min 内的木僵行为（freezing ），检测环境相关的条件性恐惧记忆。

实验结果显示，训练阶段，MSEW雌雄性大鼠联想学习无损伤。环境相关的条件性恐惧记忆测试中，MSEW雄性大鼠恐惧记忆增强。

图2MSEW大鼠模型条件性恐惧训练阶段不动时间（A）及环境相关的条件性恐惧实验不动时间（D）

3. MSEW雌性大鼠显示空间工作记忆能力轻微下降。Y迷宫空间识别实验可用于空间工作记忆测试。训练期，关闭一个臂，让大鼠在其他两个臂自由探索5min. 15min间隔后进入测试期，打开之前关闭的臂（新臂），大鼠在三个臂自由活动5min，记录大鼠在各个臂探索的时间和路程，空间工作记忆损害的动物在新臂中探索的时间和路程会缩短。本实验结果显示，雌性大鼠在测试期第一分钟内探索新臂时间虽增多，但与其他臂比较，无显著性差异。雄性大鼠探索新臂时间增多，与其他臂比较，有显著性差异。

图3雌雄MSEW大鼠模型在Y迷宫实验测试期第一分钟内探索各臂时间的时间（A,B）

4. MSEW雌雄大鼠空间参考记忆无损伤。Barnes迷宫实验可用于检测动物的空间参考记忆能力。Barnes迷宫尺寸为直径120cm的白色哑光圆盘，上有12个直径10cm圆洞，等距分布在圆盘边缘，逃避盒固定在某一目标洞下。实验时伴有强光（白炽灯，250 lux）和噪音刺激（吹风机，80 db）。在Barnes圆盘周围放置圆形、方形等空间参照物。适应阶段：将实验鼠放于逃避盒中适应2 min。训练阶段：将动物放于巴恩斯迷宫平台中央的起始盒中，5ｓ后移走起始盒，打开实验平台上的光源和吹风机，实验动物以随机方向开始探索迷宫，若动物成功进入躲避盒，关掉吹风机，使其躲避盒中适应30 s（盖上盖子），若实验鼠在4 ｍｉｎ内未进入躲避盒，则由实验者引导进入，并令其在躲避盒中适应30 s。每次实验间隔用７５％酒精擦拭迷宫表面和躲避盒并转动迷宫，消除上次实验过程中实验鼠遗留的气味和排泄物线索，确保实验鼠通过自身空间记忆线索找到目标洞。目标洞始终固定于同一方位，每天训练3次，每次4 min，训练2d。从第二次训练开始，每次训练之前将迷宫随机转动一至数个洞的位置，但目标箱始终固定在同一方位。空间探索阶段：训练结束后24 h，进行空间探索实验。移除目标洞，实验动物自由探索迷宫90s，测试其空间记忆能力。本实验结果显示，雌雄大鼠MSEW模型对Barnes迷宫实验训练期和探索期寻洞潜伏期与对照组相比，均无显著性差异。

图4雌雄MSEW大鼠模型在Barnes迷宫实验训练期（A,B）寻洞潜伏期及探索期寻洞潜伏期及在目标洞周围的时间（C,D）

5. MSEW 雌雄大鼠前额皮层谷氨酸能神经元电生理变化。MSEW 雌雄大鼠前额皮层神经元的阈值和幅度没有影响。在400和500pA刺激下，MSEW雄性大鼠谷氨酸能神经元动作电位数目减少，提示神经元兴奋性下降。

图5雌雄MSEW大鼠模型前额皮层谷氨酸能神经元阈值和幅度（A,B）及400和500pA刺激下，产生的动作电位数目（C,D）

1. 实验动物及分组：SD孕鼠。实验分为雌性对照，雌性MSEW组，雄性对照，雄性MSEW组。

2. 实验仪器：旷场实验箱、高架十字迷宫实验箱、条件性恐惧测试分析系统

3. 实验操作规程：

大鼠幼崽出生第二天至第五天(postnatal day，PND2-5天)，从母鼠家笼移出，放置在另外房间的母子分离实验箱，4h/d, 实验箱分隔成开放独立的小隔间，每个隔间内放置一只幼崽。实验箱放在加热垫上，温度维持在32℃左右。PND 6-16天, 母子分离8 h/d，母子分离实验在光照期进行，固定在8:00-18:00时间段。PND17天,大鼠幼崽离乳，雌雄分笼。正常对照组幼崽始终在母鼠家笼，至PND 21天离乳，正常换水，换料，其余不予干扰。PND 6O天，进行空场实验、高架十字迷宫实验、新物体识别实验、Y迷宫实验及Barnes 迷宫实验。行为学实验结束，每组取3只动物，麻醉，取脑，进行前额皮层神经电生理检测。

生命早期（胚胎、新生儿、幼年）是机体脑发育的关键时期，对应激的敏感性极高。该时期的应激因素（如丧亲、长期与父母分离以及儿童期受虐或忽视），可破坏脑的结构和功能的形成，对机体产生长期甚至是终生的影响，其中对情绪和认知功能的影响最大，是青少年及成年神经精神疾患的高风险因素之一。

大鼠对环境的应激反应更为敏感，本研究建立了大鼠母子分离加早期离乳（Maternal separation with early weaning, MSEW）应激模型，用于模拟生命早期应激事件。这种双重应激模型更好的模拟了人类累计的应激效应（“cumulative”stress）导致青少年和（或）成年发生神经精神疾患的现象。本研究观察了MSEW模型雌雄大鼠成年的行为学表型和神经电生理变化。