线栓法致大鼠缺血性脑卒中模型

1.评价指标体系

1.1行为学评分：通过大鼠神经损伤严重缺损评分（Neurological Severity Scores, NSS）对其前肢屈曲情况、肌张力、神经损伤情况进行评价。分数越高，动物的行为障碍越严重，缺血引起的神经损伤越严重。

①提鼠尾观察前肢屈曲情况，如双前肢对称伸向地面计为0分，如手术的对侧前肢出现腕屈、肘屈曲计为1分，肩内旋计为2分，既有腕射屈曲又有肩内旋者计为3分；②将动物双前肢置于金属网上，观察双前肢的肌张力。双前肢肌张力对等且有力者计为0分，同样根据手术对侧肢张力下降程度不同计为1、2、3分；③动物有不停向一侧转圈者，根据转圈情况计为0-3分。

1.2TTC染色

1.3HE病理染色

2. 国内外现有模型的异同

3. 技术难点

（1）手术难度：本实验室采用永久性大脑中动脉阻塞模型，该手术症状严重，若操作不熟练则动物死亡率较高，具有很大的难度，对操作人员具有很高的要求。

4. 创新性

5. 应用价值

本研究在SD大鼠上建立永久性缺血性脑卒中模型并进行了评价，可以用于药物的筛选和机制探究。

动物饲养于中国中医科学院中药研究所的屏障环境，12 h 照明/12 h 黑暗( 照明: 8: 00-20:00) ，饲养期间给予动物标准饲料和洁净饮水。本动物实验遵守国际实验动物伦理学要求。

3.1动物基本情况

与假手术组相比，模型组动物精神萎靡，进食量减少，活动减少，存活率如图1所示。

图1 各组动物造模后24、48、72h存活率

3.2动物神经损伤评价

由图2可见，与Sham组比较，模型组大鼠前肢屈曲、肌张力和转圈情况逐渐加重。如图3所示，模型组大鼠3天行为总分显著升高(P<0.001)，提示脑缺血可诱发异常行为和运动，统计第3天总得分与第1天总得分的差异以评价疾病进程，如图所示，模型组大鼠运动能力在第3天显著下降(P<0.001)。

图2各组大鼠前肢屈曲、肌张力、转圈情况

图3各组大鼠行为学总分统计及第3天得分与第1天得分差异

3.3TTC评价脑组织梗死率

图4 动物脑组织梗死率

TTC可将正常脑组织染成红色，而将梗死区染成白色。如图4所示，与Sham组相比，模型组梗死面积明显增大(P<0.001)。

3.4动物脑组织病理变化

由图5可见，模型组动物皮层和海马体CA1、CA3、DG区可见组织结构变化，细胞丢失严重。

图5动物脑组织HE染色

4讨论和小结

缺血性脑卒中仍是威胁人类健康的疾病，临床上有药物治疗、去骨瓣减压术、介入治疗等方法对脑卒中进行治疗，主要非介入治疗方法是针对急性期的血液循环障碍和神经元毒性采取的溶栓、抗炎抗氧化和减轻脑血肿水肿等措施控制继发性脑损伤，脑血流的快速恢复是缺血性脑卒中的首选治疗方法，是降低其病死率、致残率的重要手段之一。卒中诊疗受到越来越多的重视，寻找有效的治疗策略对缺血性卒中的预后极为重要。目前，越来越多的学者致力于天然药物抗脑缺血再灌注损伤的研究，特别是植物源性天然药物具有多种有益作用。

本研究在SD大鼠上建立永久性缺血性脑卒中模型并进行了评价，可以用于药物的筛选和机制探究。

1.1实验动物

雄性SD大鼠12只（购自北京市维通利华实验动物技术有限公司），8周龄，体重280-330g，许可证号：SCXK2017-0005。动物购入后于SPF级动物房中饲养。自由进食给水，保持实验室安静，实验室温度22-25oC，湿度50-60%，明暗周期12h/12h。

1.2实验材料

手术器械购于上海医疗器械(集团)有限公司手术器械厂；线栓购于北京西浓科技有限公司；TTC购于上海希格玛高技术有限公司。

2实验方法 2.1分组及

造模方法

适应性饲养4天，根据体重将动物随机分为假手术组（n=6）和模型组（n=6），各组于第5天分别完成假手术和造模处理，并在第5、6、7天进行行为学评价。 所有大鼠在术前禁食12h，自由饮水。动物称重后，用异氟烷气体麻醉（5%深度麻醉，2% 维持麻醉），备皮，仰卧固定于鼠板。颈部正中切开皮肤，钝性分离右侧颈总动脉、颈外动脉、颈内动脉，仔细分离避免损伤迷走神经。向内找到颈总动脉（CCA），分离至血管表明光滑在CCA上垫两根线，远心端系一个活扣，两根线之间的距离尽量拉大；向远心端找到颈外动脉（ECA），穿线，结扎；用动脉夹夹闭颈内动脉（ICA）。用眼科镊挑起CCA，用显微弹簧剪在两段线中间剪一小口；用眼科镊插入直径0.23~0.26mm的线拴，插到ICA血管夹位置后，系紧CCA远心端的活扣以固定线拴，打开ICA上的血管夹；继续插入线拴，直到(18±0.5)mm标记处，微遇阻力时停止。缚紧活扣，剪去多余的线头和线拴尾部；用生理盐水溶解青霉素钠粉末，用注射器吸取青霉素钠液体，冲洗颈部伤口，将腺体推入肌肉筋膜内层，缝合肌肉；将注射器针头伸入缝合的肌肉缝隙中，推注青霉素钠液体，清理后缝合皮部。假手术组大鼠只分离暴露颈总动脉、颈外动脉、颈内动脉，结扎颈外动脉。造模结束后，保留线栓至实验终点，造成大鼠永久性缺血性脑卒中模型。

2.2观察和行为学检测 2.2.1 一般观察

记录动物体重，观察动物毛发、精神状态和动作灵活性等一般外在形态，记录各组存活率。

2.2.2大鼠神经损伤严重缺损评分（Neurological Severity Scores, NSS）

造模24h、48h、72h后进行评分，如下。

①提鼠尾观察前肢屈曲情况，如双前肢对称伸向地面计为0分，如手术的对侧前肢出现腕屈、肘屈曲计为1分，肩内旋计为2分，既有腕射屈曲又有肩内旋者计为3分；②将动物双前肢置于金属网上，观察双前肢的肌张力。双前肢肌张力对等且有力者计为0分，同样根据手术对侧肢张力下降程度不同计为1、2、3分；③动物有不停向一侧转圈者，根据转圈情况计为0-3分。分数越高，动物的行为障碍越严重。

2.3取材及TTC染色

1.取脑组织：剪去右心耳后用预冷的生理盐水灌流，断头处死（约耳后处），用剪刀纵向剪开皮肤和肌肉，暴露头骨，将头骨向两侧轻轻掰开，用眼科镊夹断视神经，剥离完整的嗅球、大脑和小脑，放入培养皿，用预冷的生理盐水冲洗；

2.切片：脑组织摆放入大鼠脑模具后，用单面刀片进行切片，每隔2mm切一片，视神经分叉处插入第一支刀片，向上切2片，向下切4片；

3.染色：将切片置于装有2% TTC染液的避光的六孔板中，置于37°C水浴锅中孵育，每5min翻面以保证充分接触染液，孵育20min后放入4%多聚甲醛固定30min；

4.拍照：固定后取出置于黑色容器上，用滤纸吸去边缘水分，正反面分别拍照；

5.梗死面积统计：借助Image J测定梗死面积；计算梗死率，梗死率=（双面梗死总面积/双面脑切片总面积）×100%。

2.4HE染色

（1）预处理过程

使用常规方法对切片进行脱蜡，再水合，在二甲苯中浸泡5min，重复两次，用无水乙醇浸泡5min，再在95%乙醇中浸泡5min，在85%乙醇中浸泡5min，在70%乙醇中浸泡5min，最后用PBS浸洗3min共3次。

（2）染色步骤

首先，将切片浸入试剂盒中的试剂一（核染液）染缸中染色3-5min，用水洗约30-60s；

其次，将洗涤后的切片浸入试剂二（分色液I）中约20s后用水洗约30-60s；

再次，将洗涤后的切片浸入试剂三（分色液II）中约40s后用水洗约30-60s；

最后，将洗涤后的切片置于试剂 死浆染液中进行染色，2min后再用试剂五（增色液）洗去多余的染液，共洗2次，用滤纸吸干试剂，封片进行镜检。

2.5 数据分析

采用 Graphpad Prism 9. 0，组间比较使用单因素方差分析或独立样本 t 检验。

1. 目的

缺血性卒中( Cerebral Ischemic Stroke，CIS) 是由脑的供血动脉狭窄或闭塞、脑供血不足导致脑组织坏死的总称。统计资料表明，我国脑卒中的死亡率是欧美国家的4～5倍、日本的3.5倍；每年新发病例数超过200万，死亡人数超过百万。通过线栓法构建能够很好模拟老年或有动脉粥样硬化等基础疾病的人群突发的高死亡率、预后较差的缺血性脑卒中，可用于缺血性卒中血管损伤的药效评价。

2. 意义

脑卒中是疾病负担的主要原因[1]，缺血性脑卒中占脑血管病的80%左右[2]，主要因脑血管局部动脉粥样硬化、血栓脱落及血管损伤等导致脑供血动脉栓塞，从而引起相应脑组织缺血、坏死，具有患病率高、复发率高、死亡率高等特点，严重影响生活质量[3]。2021年发表的《中国脑卒中15年变化趋势和特点》[4]显示，在过去的近多年中，我国脑卒中现患人数高居世界首位，患病率呈上升趋势且趋于年轻化，经济负担持续加重。

3. 国内外研究进展

国内外文献中已报道的造成体力疲劳动物模型的方法有：线栓法、光化学诱导法、开颅法、双侧颈总动脉结扎等方法构建的一系列用于缺血性脑卒中的动物模型，其中，线栓法是最为常用的方法，具体操作为将一根特制的线栓沿颈总动脉或颈外动脉向内插入直至堵塞大脑中动脉，针对不同的实验目的可调整具体的缺血和再灌注时间等，如有短暂大脑中动脉闭塞、缺血再灌注损伤、永久性大脑中动脉阻塞等。 我们采用雄性SD大鼠，通过线栓法建立永久性缺血性脑卒中模型，造模后连续3天观察并记录动物状态、体重、行为学，并在造模后第3天借助TTC染色评价动物脑组织梗死面积，通过HE染色观察脑组织病理变化。

参考文献：

[1] Johnston SC, Mendis S, Mathers CD. Global variation in stroke burden and mortality: estimates from monitoring, surveillance, and modelling. Lancet Neurol. 2009 Apr;8(4):345-54.

[2] Randolph SA. Ischemic Stroke. Workplace Health & Safety. 2016, 64(9): 444.

[3] 《中国脑卒中防治报告2019》概要[J].中国脑血管病杂志,2020,17(05):272-281.

[4] 王亚楠,吴思缈,刘鸣.中国脑卒中15年变化趋势和特点[J].华西医学,2021,36(06):803-807.