气管滴注细颗粒物加重小鼠心肌缺血模型

1.评价指标体系

1）心电图：以“ST段抬高”作为心肌缺血的一个评价指标。当心肌缺血是，ST段抬高，而滴加细颗粒物能够导致ST段抬高更为显著，且持续时间较长。

2）心脏超声：评价左心室射血分数（LVEF）、左室短轴缩短率（LVFS）和主动脉流出道血流（AV Peak Vel），当上述值降低时，说明左心室功能障碍。

3）心脏TTC染色：TTC 染液能与正常组织中的脱氢酶反应而呈红色，缺血组织内呈苍白色。

4）心肺组织病理HE染色：通过心肺组织病理染色，观察心肺组织病理性改变和组织结构性改变。

5）心肌损伤标记物：当心肌损伤时心肌损伤标记物：cTnT、CK-MB、LDH显著升高。

6）血清炎症因子：检测血清中炎症因子：IL-6、TNF-α、MCP-1等炎症因子，当心肌损伤时而导致炎症因子增加，而滴注细颗粒物后显著增加炎症因子水平。

2. 国内外现有模型的异同

目前对于在研究细颗粒物致心血管损伤研究中，Hongyun Wang等通过将雄性C57BL/6J小鼠长期暴露于空气收集的PM2.5（12小时/天，每周7天，6个月）染毒，成功构建PM2.5诱发的心肺损伤模型。Chenxu Ge等同样采用长期暴露（6小时/天，每周5天，6个月）成功构建PM2.5诱发的心肺损伤模型。Zenghua Qi等人则将C57BL/6J小鼠直接长期饲养暴露于PM2.5中6个月，从而成功构建PM2.5导致的心功能障碍模型。Siqi Wang等人基于ApoE−/−小鼠，通过高脂喂养合并PM2.5气管滴注（每周1次，共8周），成功构建PM2.5加重动脉粥样硬化模型。Jun-Jiang Chen等人通过主动脉缩窄术首先构建慢性缺血模型，造模成功后将缺血小鼠暴露在PM2.5浓缩暴露装置中（6小时/天，5天/周，8周）。可见与单纯长期暴露，复合模型能够缩短造模周期和染毒时间，同时该模型也更符合临床病理发展进程。

3. 技术难点

（1）手术难度：本实验室采用结扎冠状动脉左前降支构建心肌缺血模型，该手术需要开胸，气管插管连接呼吸机，还需要在体式显微镜下进行操作，具有很大的难度，对操作人员具有很高的要求。

（2）气管插管：该模型需要多次进行气管滴注，需要采用非暴露式插管进行染毒。

（3）动物成活率和成模率：本实验采用两种因素复合造模，若操作不熟练将会导致死亡率过高，且成模率过低，导致实施难度大

4. 创新性

（1）采用两种复合因素造模，更好的模拟疾病的病理进程

（2）采用细颗粒物标准品进行染毒，实现通过增强毒力缩短了造模时间。

5. 应用价值

采用气管滴注复合心肌缺血造模，能很好地模拟细颗粒物加重心血管疾病的疾病环节。因此，该模型为研究细颗粒物导致心血管疾病机制研究以及药效学研究提供了一个已操作、稳定可控的动物模型。

动物饲养于中国中医科学院中药研究所的屏障环境，12 h 照明/12 h 黑暗( 照明: 8: 00-20:00) ，饲养期间给予动物标准饲料和洁净饮水。本动物实验遵守国际实验动物伦理学要求。

3.1心肌缺血手术过程及二导联心电图检测小鼠心肌缺血时ST段的抬高及DPM 暴露后的影响

结扎冠状动脉左前降支成功建立小鼠心肌缺血模型。临床检测显示ST段抬高，往往预示着存在急性心肌缺血，甚至心肌梗死，因此本研究选用ST段是否抬高作为评价心肌缺血模型的指标之一。结果显示：MI 组小鼠 ST 段显著升高。

MI+DPM复合组ST段升高更为显著，且呈弓背向上抬高，且持续抬高时间较长。

图1 DPM 暴露对心肌缺血时 ST 段的影响（n=12）

Figure 1 Effect of DPM on ST segment of Myocardial ischemia

3.2细颗粒物对心肌缺血小鼠左心室结构相关功能的影响

通过小动物超声检测左心室相关指标：左心室射血分数（LVEF）和左室短轴缩短率（LVFS），结果如图2所示：与 Sham 组相比，MI 组小鼠LVEF和LVFS显著降低（P<0.01）；与 MI 组相比，MI+DPM 组LVEF和LVFS持续下降（P<0.01）。

图2 DPM 暴露对小鼠心肌缺血后心室结构及功能的影响

Figure 2 Effects of DPM exposure on left ventricular systolic function after myocardial ischemia in mice（n＝12，Mean ± SEM），与Sham组相比，**P＜0.01；与MI组相比，#P＜0.05；##P＜0.01

3.3细颗粒物对心肌缺血小鼠主动脉流出道血流的影响

术后 24 h 后利用小动物超声检测小鼠主动脉流出道血流（AV Peak Vel），结果如下表所示：与 Sham 组相比，MI 组小鼠主动脉流出道血流显著降低（P<0.05）;与 MI 组相比，MI+DPM 组小鼠主动脉流出道血流呈下降趋势，但无统计学差异

表1 DPM 暴露对小鼠心肌缺血后对主动脉流出道血流的影响（n=6）

Table 1 Effects of DPM exposure on aortic valve peak flow velocity aftermyocardial ischemia

与Sham组相比，*P＜0.05；

3.4细颗粒物对心肌缺血小鼠心肌梗死面积的影响

TTC（2,3,5-氯化三苯基四氮唑）是脂溶性光敏感复合物，常用于检测组织缺血性梗塞。TTC 染液是呼吸链中吡啶-核苷结构酶系统的质子受体，能与正常组织中的脱氢酶反应而呈红色，而缺血组织内由于脱氢酶活性下降，不能反应，故不能产生变化呈苍白色。见图 4-3，与假手术组（Sham）相比，心肌缺血组（MI）梗死面积显著增大；与 MI 组相比，复合模型组（MI+DPM）心肌梗死面积增加。

图3DPM 暴露对小鼠心肌缺血后心肌梗死面积的影响

Figure 3Effects of DPM exposure on myocardial infarctionarea after myocardial ischemia in mice（n=6，与Sham组相比，**P＜0.01）

3.5细颗粒物对心肌缺血小鼠肺组织病理变化的影响

对各组小鼠肺组织进行 HE 病理染色，结果如图4所示，Sham 组肺泡壁

较薄，结构完整，无充血及水肿，也无炎症细胞浸润现象。较 Sham 组相比，MI组小鼠肺组织中可见肺泡壁明显增厚，支气管管腔结构异常，并伴有大量嗜酸性粘液分泌，肺组织可见明显的出血症状。与 MI 组相比，MI+DPM 复合模型组，出现了肺泡壁的断裂，支气管管腔的嗜酸性粘液分泌增多和黑色颗粒物积现象，其余症状与 MI 组相比无明显差异。

图4 DPM暴露对小鼠心肌缺血后对肺组织病理变化的影响（X400）

Figure 4Effects of DPM exposureon pathological changes of lung tissue after myocardial ischemia in mice

3.6 细颗粒物对心肌缺血小鼠心肌组织病理变化的影响

心肌组织病理结果如下图5所示：Sham组小鼠心肌组织结构完整，心肌纤维排列规则整齐，横纹清晰，染色均匀，细胞组织间无明显炎症细胞浸润，无组织坏死；与Sham组相比，MI组小鼠心肌纤维部分区域排列不规则，可见心肌纤维化，细胞肿大并伴有空泡，胞质染色不均匀，细胞间质有炎症细胞浸润，少量心肌纤维呈点状坏死，可见胞质淡染，核固缩、破裂或溶解消失；与MI相比，MI+DPM组心肌细胞肿胀伴有空泡，可见局灶性组织细胞坏死，局部可见结缔组织增生，并伴有大量炎性细胞浸润。

图5 DPM暴露对小鼠心肌缺血后对心肌组织病理变化的影响()

Figure 5 Effects of DPM exposure on pathological changes of lung tissue after myocardial ischemia in mice

3.7细颗粒物对心肌缺血小鼠血清心肌损伤标记物影响

结果如图6所示，与Sham组相比，MI组小鼠血清中的LDH明显升高（P<0.0001）；与MI相比，MI+DPM组能够升高血清中LDH的含量（P<0.0001）；与Sham组相比，MI组血清中cTnT和CK-MB无明显变化；与MI相比，MI+DPM组小鼠血清中cTnT，CK-MB含量急剧升高（P<0.001；P<0.05）。

图6 DPM暴露对小鼠血清心肌损伤标记物LDH，cTnT，CK-MB的影响

Figure 6 Effects of DPM exposure on LDH and cTnT in serum

注：与Sham组比较，****P＜0.0001；与MI组比较， #P＜0.05； ###P＜0.001； ####P＜0.0001

3.8 细颗粒物对心肌缺血小鼠血清中炎症因子表达水平的影响

结果如图7所示：与Sham组相比，MI组小鼠血清IL-6含量显著升高（P<0.0001）；与MI组相比，MI+DPM组IL-6含量同样显著升高（P<0.0001）；

MI组血清中TNF-α与Sham组含量相比有轻微升高，但无统计学差异；与MI相比，复合模型组MI+DPM 中TNF-α含量明显升高（P<0.0001），与Sham组相比，MI组小鼠血清中MCP-1的含量急剧升高（P<0.0001）；与MI组相比，MI+DPM组含量水平下降（P<0.01）。

图7 DPM暴露对小鼠血清炎症指标IL-6，TNF-α，MCP-1的表达水平的影响

Figure 7 Effects of DPM exposure on the expression levels of IL-6, TNF-α and MCP-1 in serum

注：与Sham组比较，****P＜0.0001；与MI组比较， ###P＜0.001； ####P＜0.0001

1实验材料1.1实验动物

选择SPF级C57小鼠，雄性，6-8周龄，体重20-25 g，共48只；由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，许可证号SCXK（京）2016-0011。分笼饲养，每笼5-6只，共9笼。实验场地由中国中医科学院中药所动物房提供，在SPF级条件下饲养管理，室温（22±1）℃，相对湿度40%-60%，12 h明暗循环照明。本研究所有动物实验相关操作均在中国中医科学院动物伦理委员会的批准下进行。

1.2实验材料

三溴乙醇；叔戊醇；TTC染液；4%多聚甲醛；BCA蛋白定量试剂盒；RIPA裂解液（中）；无水乙醇；二甲苯；HE染液套装；中性树胶；IL-6、TNF-α、MCP-1试剂盒

小动物呼吸机（ALC-V8S，上海奥尔科特生物科技有限公司）；实验用冷光源（F－150C，RWD）；小动物超声影像系统（VISUALSONICS,Vevo2100）；精细手术剪和手术镊（德国医疗器械（集团）有限公司手术器械厂）；体视显微镜（OlymPus N2，日本奥林帕斯公司）；1/10万电子分析天平（BP211D德国Sartorius公司）；多管涡旋振荡器（北京踏锦科技有限公司）数控超声器（昆山市超声仪器有限公司）；qPCR分析仪（qTower-3G；德国耶拿分析仪器股份公司）；莱卡半自动石蜡切片机（RM2245，日本莱卡公司）；莱卡全自动脱水机（AsP200S，日本莱卡公司）；小动物心电图机（FX-8222T，北京福田电子医疗仪器有限公司）；照相机（EOS-600D，Canon）；正置光学显微镜（Nikon EcliPse E100，日本尼康）；Multiskan MK3酶标仪；日立7600全自动生化仪

2实验方法2.1分组及实验

C57雄性小鼠按体重随机分为3组，实验分组如下：

（1）假手术组（Sham）：0.9%生理盐水气管滴注1周（1 mg/mL，50 μL/次，2次/周），染毒一周后进行冠状动脉左前降支只穿线不结扎

（2）模型组（MI）：0.9 %生理盐水气管滴注1周（1 mg/mL，50 μL/次，2次/周）后进行冠状动脉左前降支结扎

（3）复合模型组（MI +DPM）：DPM混悬液气管滴注1周（1 mg/mL，50 μL/次，2次/week）后进行冠状动脉左前降支结扎

2.2指标检测2.2.1肢体二导联心电图检测

冠状动脉左前降支LAD结扎术前，连接肢体导联心电图，记录正常状态下心电图，LAD结扎后1 min内，观察S-T段变化，并记录二导联心电图。LAD结扎后二导联心电图S-T段明显抬高，即为造模成功。

2.2.2心脏超声检测

手术造模后24 h，采用Vevo 2100小动物超声仪进行心脏超声检查。首先采用三溴乙醇对小鼠进行麻醉，接着小鼠仰卧位固定，在手术备皮处涂抹超声耦合剂，四肢与生理监测电极相连，监测心率、呼吸频率等基础数据并记录心电图变化。使用小动物超声检测左心室射血分数（left ventricular ejection fraction, LVEF）左室短轴缩短率（left ventricular fractional shortening, LVFS）和主动脉瓣最大血流速度（aortic valve Peak flow velocity, AV Peak Vel）。

2.2.3心脏组织TTC染色

将心脏灌流，洗净多余残血，用锡纸包裹置于-20 ℃冻存20 min，取出置于心脏模具（提前预冷）中，在结扎线下平行于冠状沟将心脏切成2 mm厚的切片4片，用滤纸吸去多余水分后，放入预热的TTC染液中，于37℃恒温避光振摇染色15 min。正常心肌组织被染为红色，梗死心肌呈淡白色，染色结束后拍照记录。用Image J软件进行图像分析，测量每片的梗死面积和总面积，每层梗死体积为该层梗死面积和层厚的乘积，各层的梗死体积之和即为总的梗死体积。

2.2.4心，肺组织HE病理检测

心肺组织苏木精－伊红（HE）染色

（1）取出已固定的组织，厚度约4mm，放入脱水盒中，做好标记

（2）脱水与透明

（3） 浸润包埋：透明的组织块放入其中，迅速冷却后包埋

（4） 切片、展片和烤片

（5） 石蜡切片脱蜡至水

（6） 苏木素染色

（7） 伊红染色

（8） 脱水封片

（9） 在光学显微镜下拍照存取图像，并进行分析

2.2.5血清心肌损伤酶生化指标检测

于所有处理结束后24 h内，小鼠摘眼球取血。静置2h后，4℃，3000 rpm，离心15 min。取上清，检测以下指标：乳酸脱氢酶（LDH），按照试剂说明书操作，使用自动生化仪进行测定；肌红蛋白（cTnT）采用酶联免疫法（ELISA）进行测定。

2.2.6 ELISA检测血清炎症指标IL-6，TNF-α，MCP-1的表达水平

小鼠血清中IL-6、TNF-α、MCP-1含量均采用ELISA检测试剂盒检测，按照试剂盒说明书操作。

2.3数据分析

实验结果以均数±标准误（Mean ± SEM）表示，使用GraphPad Prism 8软件，对数据进行单因素方差分析（ANOVA），组间差异的比较用Dunnett's Multiple Comparison检验；当P< 0.05时判定两组间具有显著性差异。

1.目的

在医学研究中，选择合适的动物模型至关重要，目前已有很多公认的心血管疾病动物模型和细颗粒物（PM）暴露动物模型。目前大多数研究主要以单疾病研究为主，但单一因素的模型不适宜去研究PM2.5加重心血管疾病的潜在机制的探究，在研究复杂疾病中有较大的局限性。当前推荐使用复合模型可以更好地模拟实际情况，因此本模型将气管滴注细颗粒物染毒和心肌缺血模型结合，有利于探究PM2.5增加心血管事件的潜在机制。

2. 意义

细颗粒物（fine particulate matter;PM2.5）目前作为心血管疾病一个公认的危险因素。大量流行病学研究表明 PM2.5长期暴露能够促进冠状动脉钙化灶的形成，加速动脉粥样硬化的进程[1]；能增加高血压发病率[2, 3]；加快糖尿病病变进程[4]。一项基于我国12万成年人平均随访8年的前瞻性研究显示，PM2.5年均暴露浓度每增加10μg/m3，冠心病风险增加43%[5]。但目前PM2.5增加心血管事件的潜在介质尚不完全清楚。在探索机制的过程，选择合适的动物模型至关重要。

3. 国内外研究进展

小鼠繁殖力强、易于饲养、价格低廉、占用空间少、操作简便，品系多样使其可根据研究目的建立复合模型，且小鼠基因在一定程度与人类基因同源性强，因此我们选择小鼠为模型建立的对象。小鼠心肌梗死模型的制作方法有药物法、微创法、电刺激法、冷冻法、冠状动脉左前降支结扎法等，其中冠状动脉左前降支结扎法最为经典和常用。这种方法可直接造成左心室前降支堵塞，与临床中的心肌梗死原理贴近，试验周期短，可以观察梗死后对心肌的损害。

细颗粒物体内毒性作用研究实验中，常用的三种染毒方式为气管滴注染毒、尾静脉注射染毒和全身自由暴露法染毒。其中全身自由暴露染毒对暴露设施仪器有较高要求，实施难度较大，尾静脉注射染毒不能够完全模拟细颗粒物经气道进入人体的过程，因此与事实最相符、最常用的方法是气管滴注染毒。

目前对于在研究细颗粒物致心血管损伤研究中，Hongyun Wang[6]等通过将雄性C57BL/6J小鼠长期暴露于空气收集的PM2.5（12小时/天，每周7天，6个月）染毒，成功构建PM2.5诱发的心肺损伤模型。Chenxu Ge[7]等同样采用长期暴露（6小时/天，每周5天，6个月）成功构建PM2.5诱发的心肺损伤模型。Zenghua Qi[8]等人则将C57BL/6J小鼠直接长期饲养暴露于PM2.5中6个月，从而成功构建PM2.5导致的心功能障碍模型。Siqi Wang[9]等人基于ApoE−/−小鼠，通过高脂喂养合并PM2.5气管滴注（每周1次，共8周），成功构建PM2.5加重动脉粥样硬化模型。Jun-Jiang Chen[10]等人通过主动脉缩窄术首先构建慢性缺血模型，造模成功后将缺血小鼠暴露在PM2.5浓缩暴露装置中（6小时/天，5天/周，8周）。可见与单纯长期暴露，复合模型能够缩短造模周期和染毒时间，同时该模型也更符合临床病理发展进程。

本研究团队综合了本实验室具体情况，在没有全身暴露装置以及缩短造模时长前提下优化造模方式，选择了细颗粒物标准品为染毒物品，该标准品来源于柴油颗粒物，主要由多环芳烃(PAHs)和硝基取代的多环芳烃(硝基-PAHs)组成。PAHs是最早被发现和研究的一类持久性有机污染物，其结构稳定，可在大气、水体、沉积物、灰尘等多种环境介质中长期存在，具有半挥发性特性，由环境中各种燃料的不完全燃烧产生。多环芳烃中的代表苯并（a）芘，具有强致癌作用。因此本方法采用毒性更强，物质更确定的细颗粒物标准品混悬液进行气管滴注，既能解决实验设施弊端，又能缩短造模周期。

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4. Chen H, Burnett R T, Kwong J C, et al. Risk of incident diabetes in relation to long-term exposure to fine particulate matter in Ontario, Canada.[J]. Environmental health perspectives, 2013,121(7):804-810.

5. Li J, Liu F, Liang F, et al. Long-Term Effects of High Exposure to Ambient Fine Particulate Matter on Coronary Heart Disease Incidence: A Population-Based Chinese Cohort Study. Environ Sci Technol. 2020. 54(11): 6812- 6821.

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9. Wang S, Wang F, Yang L, et al. Effects of coal-fired PM2.5 on the expression levels of atherosclerosis-related proteins and the phosphorylation level of MAPK in ApoE-/- mice. BMC Pharmacol Toxicol. 2020;21(1):34.

10. Chen JJ, Ma WM, Yuan JL, Cui LQ. PM2.5 exposure aggravates left heart failure induced pulmonary hypertension. Acta Cardiol. 2019;74(3):238-244.