炎症性肠病大鼠模型

1.评价指标体系

1）DAI评分

分值

0

1

2

3

4

体重变化

＞99%

95%-99%

90%-95%

85%-90%

＜85%

粪便形态

正常

软便

便不成型

稀便

粘液或水样便

便血情况

无便血

/

隐血

/

便血

2）生化指标：

（1）炎性因子测定：IL-6、IL-1β、TNF-α

（2）HE染色：以结肠细胞排列、炎症浸润情况、空腔数作为动物结肠损伤的评价指标，细胞排列整齐、炎症浸润、空腔少表明损伤越小。

2. 国内外现有模型的异同

截止目前为止，国内外文献中已报道的造成炎症性肠病动物模型的方法有：化学诱导、免疫和炎症、大肠杆菌诱导等单一因素或多种因素诱导的方法构建的一系列用于炎症性肠病研究的动物模型。

而在这些方法中，化学诱导是最为常用的造成炎症性肠病的方法，如饮用DSS、TNBS灌肠、恶唑酮皮肤表面滴注及灌肠等。如：I Okayasu等对小鼠予饮用水中添加一定分子量的DSS，就可导致不同程度的炎症性肠病模型[2]；取4%~10%的乙酸1.5 mL灌入大鼠结肠内5~8 cm处，10~20 s后用0.9%氯化钠3~5 mL冲洗1次[3]；取一定量的OXZ乙醇溶液一次性经导管(距肛4 cm)灌注入结肠内[4]；用降解的1%角叉菜胶水溶液饲喂动物,数周后实验动物可导致UC。[5]；基因敲除和转基因诱导炎症性肠病模型[6]。尽管这些诱导方法能够模拟当今人们的病理状态，但因考虑因素多、操作复杂，不易控制，病变自愈能力不同、维持时间不一，重复性差，死亡率高等，造模参数各异。

3. 技术难点

（1）硅胶管或聚乙烯导管的选择。本实验室采用硅胶管或聚乙烯导管，长度为12cm，内径为2mm。既保证了能够伸入到大鼠结肠部位，又能保证不会对大鼠结肠造成另外物理伤害。为造模成功提供了基础。

（2）造模时长的选择。综合了前期文献调研和本实验室的实验基础，采用造模两次刺激，保证造模液完全被肠腔吸收，而非随粪便排除。

（3）粪便隐血检测评分。以空白组颜色以及改变时间做对照。

4. 创新性

（1）造模两次刺激，保证造模液完全被肠腔吸收，而非随粪便排除。 可以建立更稳定、更有效的动物疲劳模型。

（2）揭示了炎症性肠病与PPAR γ 有关。PPAR γ 参与炎症及免疫反应的调节，在炎症反应中发挥抗炎的作用。

5. 应用价值

采用TNBS乙醇溶液灌肠的方法，对动物麻醉后进行灌肠而造成炎症性肠病，能够很好模拟当今社会人们所处的工作环境、生活状态等因素而引起的炎症性肠病：如生活方式生活习惯的改变、腹痛腹泻、肠道菌群紊乱、免疫持续激活以及工作和生活所带来的生理和心理压力等等。因此，该模型为缓解IBD腹痛腹泻、便血的功效评价提供了一个已操作、稳定可控的动物模型。

动物饲养于中国医学科学院药用植物研究所的屏障环境，12 h 照明/12 h 黑暗( 照明: 8: 00-20:00) ，饲养期间给予动物标准饲料和洁净饮水。本动物实验遵守国际实验动物伦理学要求。

（一）TNBS乙醇灌肠致大鼠炎症性肠病的分子机制

1实验材料 1.1试剂耗材

TRIzol（Solarbio, China）；磷酸酶抑制剂（CWBIO, China）；蛋白酶抑制剂（CWBIO, China）；RIPA裂解液（Solarbio, China）；BCA 蛋白质检测试剂盒（Solarbio, China）；广谱彩虹预染蛋白Maker（CWBIO, China）；T-bet、RORy t、Foxp 3

1.2实验仪器

超声破碎仪（Sonics, USA）、小型垂直电泳仪（Bio-Rad, USA）、凝胶成像系统（Bio-Rad, USA）。

2实验方法 2.1动物实验及取材方法

动物实验及过程如前所述。

2.2转录组学分析

使用TRIzol（Solarbio, China）从对照组和IBD大鼠中提取总RNA，进行转录组学分析。使用NanoDrop和Agilent 2100对RNA质量进行评估，然后使用Illumina测序平台（HiSeqTM4000）对RNA进行测序。通过HTSeq对各基因表达水平进行分析，然后从负二项分布检验得到p值，并使用FDR (BH)进行调整。差异表达基因(DEGs)筛选的标准为p值小于0.05。

2.3蛋白质印迹分析

将大鼠结肠组织匀浆，并在含有 1% 磷酸酶和蛋白酶抑制剂混合物（CWBIO, China）的RIPA（Solarbio, China）中裂解。使用 BCA 蛋白质检测试剂盒（Solarbio, China）对匀浆中的蛋白质浓度进行定量，并调整至相同浓度。将蛋白在100℃水浴中加热5 min使蛋白变性，并保存与-80℃。

上样25-50 ug 变性蛋白质和3 ul广谱彩虹预染蛋白Maker（CWBIO, China）进行电泳。之后转膜至硝酸纤维素膜（0.2 μm）上。膜在5%脱脂牛奶中封闭1.5小时，并在4℃下孵育特异性一抗过夜。随后，在室温下孵育二抗（CWBIO, China）1.5 h（山羊抗兔和山羊抗小鼠IgG H&L，在1：5000稀释）。使用增强的化学发光方法在凝胶成像系统（Bio-Rad, USA）中曝光，使蛋白质表达可视化。最后将蛋白条带强度与相应的总蛋白或 GAPDH比进行标准化。

2.4组织病理和免疫组织化学分析

将大鼠结肠组织用4%多聚甲醛缓冲液固定24 h，然后用石蜡包埋。切下5 um厚的结肠切片，并用苏木精和伊红（H&E）染色。

2.5数据分析

使用 ImageJ 软件（1.8.0, National Institutes of Health, USA）对蛋白条带进行定量。使用t检验分析两组数据之间的差异。使用单因素方差分析用于两组以上的比较。当数据偏离正态分布时，使用非参数检验。使用 SPSS 25.0软件（IBM Corp., USA）进行统计计算。 所有数据均表示为平均值±平均值的标准误差（SEM），以p < 0.05判断为显著。 使用 GraphPad Prism 7.0（USA）绘制图形。

3实验结果 3.1 TNBS乙醇溶液灌肠致大鼠肠上皮细胞炎症浸润

为了研究TNBS乙醇溶液灌肠诱导大鼠IBD发生的机制，我们对与胃肠道运动相关的结肠组织进行了研究。对TNBS乙醇溶液灌肠造模后，HE染色观察结肠组织形态，空白对照组结肠组织切片中，黏膜上皮细胞排列整齐紧密，模型组炎性细胞严重浸润，杯状细胞缺失。上述表明，TNBS乙醇溶液灌肠造模可造成大鼠肠黏膜上皮细胞出现破裂、炎症介质浸润。

3.2 IBD大鼠结肠转录组学研究

为了系统地研究TNBS乙醇溶液灌肠对大鼠结肠部位产生的影响，通过转录组测序分析了对照组和TNBS乙醇处理大鼠的结肠。在对照组与模型组中共发现了x个差异表达基因（DEGs）。其中模型组显著上调了195个基因，显著下调了44个基因(图8a)。KEGG富集分析结果表明。。基于KEGG结果的热图显示，x信号通路、基因均受到TNBS处理的显著调控(图8b)。GO分子功能分析表明，；细胞成分分析显示，；并且在生物过程中也富集了许多x过程相关的代谢途径(图8d)。转录组分析结果表明，TNBS乙醇致大鼠炎症性肠病的原因与。。有关，并与。。AMPK信号通路密切相关。

图8 通过RNA-Seq分析TNBS乙醇对大鼠结肠基因表达的影响（mean ± SEM，n=3）。（a）结肠中x个特异性DEGs的火山图；（b）DEGs的KEGG富集分析；（c）信号通路相关的DEGs表达热图; （d）DEGs的GO富集分析。

3.3 TNBS乙醇诱导IBD结肠组织炎症、溃疡与PPAR γ

PPAR γ 参与炎症及免疫反应的调节，作为巨噬细胞的负调节因子，在炎症反应中发挥抗炎的作用。PPAR γ 配体抑制免疫、炎症反应可能与抑制 IκB 磷酸化有关。PPAR γ 激活有助于下调 Th1 细胞因子(INF-γ、 TNF-α)，上调 Th2 细胞因子(IL-4、IL-10)，调节 T 细胞分化。

4小结

本研究证明了IBD大鼠的炎症与过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPAR γ）有关。TNBS乙醇溶液诱导的炎症性肠病是由于免疫激活而引起的，这主要与PPAR γ/T细胞调节有关。通过调控PPAR γ/NF-κB信号通路，释放炎性因子，调节T细胞分化，导致炎症性肠病发生。这些证据为治疗TNBS乙醇溶液诱导炎症性肠病提供了思路。

（二）以美沙拉嗪为阳性药，对戊己丸治疗IBD大鼠的功效进行评价验证

1实验材料 1.1实验动物

SD雄性大鼠60只，6周龄，体重220-240 g，购自北京市维通利华实验动物技术有限公司，许可证号：CXK（京）2021—0011、SCXK（京）2021—0006。动物购入后于SPF级动物中心饲养。保持饲养环境安静，室温22-25℃，湿度50%-60%，明暗交替周期12 h/12 h。整个实验过程中大鼠可自由进食进水。

1.2实验试剂和仪器

TNBS（sigma）；粪便隐血试剂盒（雷根生物）；戊巴比妥钠（sigma）；炎性因子Elisa试剂盒。阳性药“美沙拉嗪”。戊己丸（李时珍医药集团有限公司）

酶标仪（Thermo scientific）。

2实验方法 2.1动物分组、造模及给药

大鼠适应性饲养4天，根据体重将动物随机分为5组，即空白对照组、模型组、阳性药组、戊己丸低剂量组和高剂量组，每组10只。

空白对照组使用生理盐水，其余各组均使用TNBS乙醇溶液灌肠刺激以建立大鼠IBD模型。实验前禁食不禁水 24h，称重，腹腔注射戊巴比妥钠（30 mg/kg）麻醉；用直径 2.0 mm 长 12 cm 的输液管经液体石蜡润滑后,通过肛门轻 轻插入结肠至标记好的 8 cm 处，一次性缓慢推入新鲜配制的 TNBS 造模溶液(150 mg/kg TNBS+50%乙醇，体积比 2:1),捏紧肛门提尾倒立 1-3 min，以避免造模液 回流，同时轻揉鼠腹，保持动物臀部高于腹部 15 min。最后，使大鼠侧卧，放回 笼中自然苏醒,之后常规饲养。

造模造模 24h 后给药，阳性药物组和戊己丸各剂量组灌胃相应剂量的药物，空白对照组、模型组灌胃等量饮用水，给药x天后，进行检测。

3实验结果 3.1戊己丸对IBD大鼠体重的影响

结果如图所示，与空白对照组相比，模型组大鼠在TNBS乙醇溶液处理后模型大鼠精神状态萎靡不振，在2-4天体重将发生一定程度的降低。之后大鼠体重开始呈现稳定增长，但仍然显著低于空白组，且戊己丸给药组的低和高剂量组与模型组相比有显著性差异。

3.2戊己丸对IBD大鼠DAI评分的影响

在整个实验过程中，与空白对照组相比，模型组大鼠在TNBS乙醇溶液刺激后DAI 评分显著降低。戊己丸和美沙拉嗪给药各组较模型组DAI评分有所升高。

3.3戊己丸对IBD大鼠相关生化指标的影响

在造模给药后，与空白对照组相比，模型组小鼠在TNBS乙醇溶液刺激后血清中炎性因子IL-1β、TNF-α显著升高。戊己丸和美沙拉嗪给药各组较模型组炎性因子有一定程度的降低。

4小结

在TNBS乙醇溶灌肠模型上，研究发现戊己丸给药后可以显著改善TNBS乙醇所致的DAI评分降低、炎症因子升高。本研究证明了戊己丸的改善严重性肠病药效，也验证了TNBS乙醇溶灌肠模型评价治疗IBD功效的有效性。

1实验材料 1.1实验动物

SD雄鼠10x2=20只（购自北京市维通利华实验动物技术有限公司），6周龄，体重220-240g，许可证号：SCXK（京）2021—0011、SCXK（京）2021—0006。动物购入后于SPF级动物房中饲养。自由进食给水，保持实验室安静，实验室温度22-25oC，湿度50-60%，明暗周期12h/12h。

1.2实验材料

TNBS（sigma）、粪便隐血试剂盒（雷根生物）、

戊巴比妥钠（sigma）

2实验方法 2.1分组及实验

适应性饲养4d，根据体重将动物随机分为以下2组（n=10）。1组为空白组，1组为模型组。各组动物于同一天进行解剖取材。

实验期间记录大鼠体重，3周后进行取材。

2.2DAI 评分 2.2.1体重变化

每日密切观察大鼠动物状态，称重，记录体重。

2.2.2粪便形态

大鼠每天观察大鼠粪便形态，记录，包括：正常、软便、便不成型、粘液状。

2.2.3粪便隐血检测

观察大鼠粪便颜色是否有血，将无明显颜色变化的大鼠粪便进行粪便隐血检测，并记录结果。

2.3取材及生化检测

在戊巴比妥钠麻醉下取血、结肠组织用于后期生化指标测量。取得血静置4h后，3500r/ min，15min离心得血清。对结肠组织剂型直观观察，对结肠黏膜损伤情况进行评分；称重，测量结肠组织重量及长度。

结肠组织立即用 4%多聚甲醛固定，梯度酒精脱水、二甲苯透明，然后进行浸蜡、包埋、切片、脱蜡、染色、脱水、透明、封片等步骤。苏木精-伊红染色后，在显微镜下观察各组结肠组织形态的病理学变化并拍照。使用ELISA 试剂盒（IL-6、IL-1β、TNF-α），按照试剂盒内说明书方法操作对血清中炎症因子进行检测。

2.4数据分析

实验结果以均数±标准误（Mean ± SEM）表示，采用SPSS 25.0进行统计分析，P < 0.05为产生统计学差异。

1. 目的

通过化学诱导的方法，构建能够很好模拟当今社会人们所处的工作环境、生活状态等因素而引起的炎症性肠病：如生活方式生活习惯的改变、腹痛腹泻、肠道菌群紊乱、免疫持续激活以及工作和生活所带来的生理和心理压力等等，以用于改善炎症性肠病药品和保健品的功效评价。

2. 意义

随着社会的进步和高速发展，人们的生活节奏及生活方式发生改变，家庭遗传因素，免疫持续激活，肠道内菌群紊乱，肠粘膜屏障防御功能减弱等因素影响，身体出现腹痛、腹泻、便血、体重减轻等症状。当今，炎症性肠病发病率呈上升趋势，严重影响患者的自我效能，降低生活质量，已成为不容忽视的健康问题。随着生活水平的提高，人们对保健品和药品的需求也在不断增大，通过服用具有缓解腹痛腹泻的保健品和减轻炎症损伤的药品可以降低或消除机体腹痛腹泻、便血的现象，使其体力恢复到正常。因此，建立稳定的炎症性肠病动物模型和功效评价方法就显得尤为重要。目前常用的方法是采用正常动物通过化学诱导炎症性肠病（IBD）模型。本研究采用化学诱导模型，即TNBS乙醇溶液灌肠的方法，造成动物肠粘膜局部免疫紊乱的状态，能很好地模拟当今人们因长期免疫应激所导致的炎症性肠病状态，如腹痛腹泻、便血、以及工作和生活所带来的生理和心理压力等。该类模型具有快速诱导炎症、易操作性和花费少的特点。

3. 国内外研究进展

国内外文献中已报道的造成炎症性肠病动物模型的方法有：化学诱导、免疫和炎症、大肠杆菌诱导等单一因素或多种因素诱导的方法构建的一系列用于炎症性肠病研究的动物模型[1]。而在这些方法中，化学诱导是最为常用的造成炎症性肠病的方法，如饮用DSS、TNBS灌肠、恶唑酮皮肤表面滴注及灌肠等。如：I Okayasu等对小鼠予饮用水中添加一定分子量的DSS，就可导致不同程度的炎症性肠病模型[2]；取4%~10%的乙酸1.5 mL灌入大鼠结肠内5~8 cm处，10~20 s后用0.9%氯化钠3~5 mL冲洗1次[3]；取一定量的OXZ乙醇溶液一次性经导管(距肛4 cm)灌注入结肠内[4]；用降解的1%角叉菜胶水溶液饲喂动物,数周后实验动物可导致UC。[5]；基因敲除和转基因诱导炎症性肠病模型[6]。尽管这些诱导方法能够模拟当今人们的病理状态，但因为病变自愈能力不同、维持时间不一，重复性差，死亡率高等，造模参数各异。

我们采用SD雄性小鼠，禁食24小时后麻醉，用长约15 cm，直径2 mm的硅胶管 (或聚乙烯导管) 由肛门轻缓插入8 cm处的肠腔内，注入50~150 mg/kg的30%~50%TNBS乙醇溶液，约2小时大鼠苏醒前，再次用造模液刺激，用胶带封住肛门部位，使造模液全部被肠腔吸收。表现在造模后2-4天体重连续下降、粪便松软、且带血或隐血、精神状态萎靡、自主活动减弱。

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