雾化吸入LPS致肺炎大鼠模型
讨论与结论
1.评价指标体系
该模型是采用雾化吸入LPS诱导的大鼠肺炎模型，通过肺组织病理学、肺灌洗液的白细胞计数以及肺组织的炎性因子（IL-1β、IL-6以及TNF-α）对于该模型进行评价。
2. 国内外现有模型的异同
相比于现有模型，在造模方法上与现有模型有不同：在造模方式上采用雾化吸入给予LPS的方式，检测指标与现有模型基本一致包括：肺组织病理学、灌洗液白细胞计数以及肺组织炎症因子。雾化给药过程中LPS药液的浓度固定，对雾化粒径以及雾化后气溶胶的浓度进行监测能够保证造模能够有很好的重复性以及较高的成功率。
3. 技术难点
对雾化用的LPS药液雾化粒径以及雾化浓度的监测保证模型的一致性以及可重复性。
4. 创新性
在造模方式上采用雾化吸入的给药方式，同时在给药过程中确定雾化液浓度，对于雾化粒径（中位粒径在3µm左右）保证药液能够吸入到肺部，雾化用LPS液体浓度固定，同时对于雾化后气溶胶的浓度进行监测这样能够保证模型的一致和可重复性。该给药方式为局部吸入给药，相对于目前的全身给药（尾静脉和腹腔）能够减少全身的不良反应。对于吸入和气管局部注射吸入给药该给药方法操作简单，动物成模率高，肺部病变均匀模型稳定可重复性高。
5. 应用价值
采用雾化LPS方法诱导的肺炎模型相较于目前腹腔及尾静脉注射给药和气管注射给药等给药方式具有模型稳定、肺部组织损伤均匀一致，全身作用小等优点，本研究方法更加科学，是对现有LPS诱导模型较好的优化和提升。因此，该模型为药物的筛选、药效评价及可能的机制探索提供了一个稳定可靠的动物模型。
生物安全性
实验动物采用SPF级大鼠，动物饲养于中国中医科学院中药研究所和平里园区实验动物房，屏障系统豚鼠房饲养，实验设施许可证SYXK（京）2019-0003。饲养期间给予动物标准饲料和洁净饮水。本动物实验遵守国际实验动物伦理学要求。
评价验证
1材料与方法
1.1材料
1.1.1药品及试剂
脂多糖(LPS)：sigma公司生产，批号：127M4030V。地塞米松磷酸钠注射液：贵州天地药业有限责任公司生产，批号：19110802A。三氯乙醛水合物：上海麦克林生化科技有限公司，批号：C10636049。甲醛：福晨（天津）化学试剂有限公司生产，批号：20190920。生理盐水：石家庄四药有限公司生产，批号：2006192110。
1.1.2仪器
口鼻暴露吸入塔：Melton Inhalogic NIES 口鼻式吸入暴露系统，eppendorf离心机，型号centrifuge 5810R；电子天平：德国Sartorius公司生产，型号；BSA3202S-CW型；显微镜及图像分析系统：日本olympus公司生产，型号；BX51；雾化器：PARI Turbo BOY N雾化器；CEL-712 Microdust Pro监测仪；Spraytec实时喷雾粒度分析仪，英国马尔文公司。
1.2方法
Wistar大鼠，170 ~190g，雄性，适应性喂养5天，根据体重随机分为3组，空白组、模型组、阳性组，每组10只。将CEL-712 Microdust Pro监测仪插入到Melton Inhalogic NIES口鼻式吸入暴露系统的暴露孔，对雾化气溶胶进行浓度进行监测。将动物装于口鼻暴露雾化腔体，在雾化器中装入4 mg/mL的LPS溶液，口鼻暴露系统与雾化装置连接，雾化吸入给与大鼠LPS溶液(LPS雾化中位粒径3um左右)15 min进行造模，每次雾化药液体积约为5mL，连续三天，第四天早上即第三次造模后16 h各组进行取材。
样本采集：造模后16 h用10%的水合氯醛麻醉（0.35 mL/100g），腹主动脉采血，暴露胸腔，右叶结扎，用生理盐水灌洗左肺，缓缓打入，静止平衡30 s，缓缓抽出，1 mL/次，灌洗2次，灌洗速度2 mL/min（30 s/次），合并灌洗液（回收率＞60%）。Wright-Giemsa染色法观察肺泡灌洗液中炎症细胞（巨噬细胞、中性粒细胞）含量。右肺用4%甲醛固定，室温保存，待进一步病理检测，制备石蜡切片供组织学检查。
观察指标：①肺组织病理形态学检查：将肺组织进行包埋、切片以及HE染色制备成肺组织病理切片，在光学显微镜下进行观察，进行肺组织病理损伤评分。②肺泡灌洗液中性粒细胞计数：肺泡灌洗液离心，将重悬后的肺泡灌洗液稀释，制成均匀的细胞悬液，取10 µL加至细胞计数板上，静止3 min，待细胞完全沉淀后，在低倍镜下数四角中10个小方格的细胞数，记为N。有核细胞总数=（N/4）*10*20*106/L，计算肺泡灌洗液中白细胞总数。将离心后的细胞沉淀用生理盐水重悬，沉淀混匀后，吸取10 µL细胞悬液涂片，待涂片风干后，至无水乙醇中固定10 min晾干，进行瑞氏-吉姆萨染色，于显微镜（油镜）下计数100个细胞，计算中性粒细胞所占百分比，再乘以白细胞总数计算肺泡灌洗液中性粒细胞量。③炎性因子检测：采用MSD技术（电化学发光技术）分别检测肺组织、血清及肺泡灌洗液中的IFN-γ、IL-1β、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-13、TNF-α、KC/GRO。
1.3统计学处理
应用SPSS 20.0统计软件对实验数据进行独立样本T检验（T-检验），以P< 0.05 为差异有统计学意义。
2结果
2.1雾化LPS浓度及粒径测定结果
检测结果雾化LPS气溶胶平均浓度为4.08g/m3，结果见图1。粒径测定结果显示LPS雾化气溶胶粒经：Dv(10)=0.6974(μm)，Dv(50)=3.387(μm)、Dv(90)= 8.836(μm)，Span=2.402，结果见图2。雾化LPS气溶胶粒径持续监测图见图3。
2.2肺组织病理结果比较
光镜病理观察：镜下显示空白组各结构正常，连续、清晰，支气管上皮完整，粘膜光滑，各层结构清晰，偶见散在炎性细胞，无渗出。模型组肺脏可见局灶或弥漫性肺泡上皮变性坏死伴脱落，炎细胞浸润（中性粒细胞和单核细胞为主）等改变。其中，11#和13#动物肺泡上皮弥漫性脱落，重度，仅个别动物（12#、20#等）可见轻度的局灶性化脓性坏死，病变较轻，整体上呈现出的肺脏明显的损伤。
肺组织病理半定量评分比较：上皮损伤。模型组、阳性对照组上皮细胞坏
死脱落发生率分别为：8/10、0/10。从损伤程度来看，模型组2只动物为重度肺泡上皮坏死脱落，阳性对照组未见肺泡上皮坏死脱落及炎性细胞浸润。模型组、阳性对照组中性粒细胞浸润在全部动物肺脏出现，但从程度上来看，模型组中性粒细胞浸润发生率为10/10，均为中度以上，阳性对照组主要为轻度以下，中度中性粒细胞浸润发生率为8/10。可见，阳性对照组可不同程度减轻炎性细胞浸润的程度，其中，阳性对照组炎性细胞浸润为轻度改变，多数动物肺泡上皮坏死脱落轻度以下，治疗保护较好，局灶性化脓性炎。模型组局灶性化脓性坏死发生率为2/10，阳性药组未见局灶性化脓性坏死。结果见表1，图4。
表1 主要病变统计
注：根据病变的分布、严重程度和形态学特点使用合适的诊断术语并将病变分为4个等级：轻微、轻度、中度、重度，分别用+、++、+++、++++表示
图4 病理图片
注：A-1、A-2 空白对照组（分别为10×、40×）；B-1、B-2 模型组（分别为10×、40×）；C-1、C-2阳性对照组（分别为10×、40×）。
3.3肺泡灌洗液中性粒细胞数
与空白对照组比较，模型组中性粒细胞显著升高（P< 0.01）。结果见图5。
3.4炎性因子
肺组织中炎性因子的变化：与空白对照组比较，模型组的IL-1β、IL-6、KC/GRO含量显著性升高（P<0.01，P<0.05，P<0.01）。
表3 肺组织炎性因子统计结果
肺泡灌洗液中炎性因子的变化：与空白对照组比较，模型组的IL-1β含量显著升高（P<0.05），IL-6、TNF-α含量也明显升高（P<0.001、P<0.001）。注：与空白组相比*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。
表4 肺泡灌洗液炎性因子统计结果
血清中炎性因子的变化：与空白对照组比较，模型组的IL-10含量具有显著性降低（P<0.05），IL-5含量明显升高（P<0.05），KC/GRO含量明显降低（P<0.01），TNF-α含量明显降低（P<0.05），结合具体数据分析认为上述数值变化较小，数值的改变仅仅有统计学意义，无生物学意义。
表5 血清炎性因子统计结果
4 讨论
使用LPS建立肺炎模型的方法主要有全身给药法、气管内给药法、吸入法及雾化法。相对于其他给药途径的造模方式，雾化吸入给药具有全身作用小、炎症反应均匀、模型重复性好等优势。在进行造模时LPS雾化粒径的大小是模型成功和可重复的关键。当吸入气溶胶粒径在1-4 μm时，肺部的药物沉积量相对稳定；当粒径大于4 μm时，肺部的药物沉积量会减少。本研究中，有50%的LPS雾化气溶胶粒径< 3.387 μm，提示LPS雾化颗粒主要沉积于肺泡。造模成功与否还与吸入的浓度相关，本研究中，用分光光度仪测定雾化的LPS气溶胶浓度平均值为4.08g/m3左右。
病理结果显示，模型组大鼠出现了较严重的上皮细胞脱落坏死以及肺脏中性粒细胞浸润，偶见局灶性化脓性坏死。同时，肺泡灌洗液中的中性粒细胞数量对肺炎的评价也非常重要。对肺泡灌洗液中炎性细胞进行统计，结果与空白对照组比较，模型组中性粒细胞总数显著升高（P< 0.01）。上述结果提示模型成功。
雾化给药为肺部靶向给药，药物作用于气管和肺组织，同时肺部作为呼吸器官，其炎症反应还会反应在全身，因此观察比较肺泡灌洗液、肺组织和血清炎性因子的改变。已有研究表明脂多糖LPS进入生物体内后，可以激活相关炎症信号通路，促进炎症因子的释放。LPS导致的内毒素模型肺损伤，是通过两个作用形成的。一是可以直接作用于内皮细胞，LPS 通过上调细胞因子，粘附分子和组织因子，导致内皮细胞的损伤。而且，LPS 还可以导致内皮细胞凋亡。另一个是激活宿主获得性防御反应，包括细胞因子和体液因子进而导致大范围的炎症介质的释放。脂多糖和大肠杆菌造成的肺损伤模型，共同的通路就是大量PMN的浸润，激活，产生大量炎症因子，包括IL-1α、IL-1β、IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α、Interferon-α、Interferon-γ等，所以本研究中选取了IFN-γ、IL-10、IL-13、IL-1β、IL-4、IL-5、IL-6、KC/GRO、TNF-α炎症因子进行检测。
造模后病理结果显示，模型动物出现了出现明显的肺损伤，肺灌洗液中白细胞计数显著升高结果提示模型成功。炎性因子检测结果显示，模型组血清所测九种炎性因子均没有出现有明显生物学意义的显著变化，而在肺组织和肺泡灌洗液IL-1β、IL-6、KC/GRO以及TNF-α均出现具有一定生物学意义的变化，两者变化基本一致，而IFN-γ、IL-4、IL-13变化不明显。LPS吸入诱导的肺炎为局部靶向模型，其病变部位主要是在肺部局部，全身的炎症反应并不明显。产生变化的炎性因子主要是IL-1β、IL-6、KC/GRO以及TNF-α，推测主要是Th1细胞因子占主导作用，Th2细胞因子分泌相对较少，导致机体朝着炎症方向发展。同时从实验结果能够看到，尽管肺组织和肺灌洗液中炎性因子均出现了显著性变化，但是肺灌洗液中模型组相对空白组变化更显著，标准差小，变化更为敏感。
制备方法
1材料与方法
1.1材料
1.1.1药品及试剂
脂多糖(LPS)：sigma公司生产，批号：127M4030V。地塞米松磷酸钠注射液：贵州天地药业有限责任公司生产，批号：19110802A。三氯乙醛水合物：上海麦克林生化科技有限公司，批号：C10636049。甲醛：福晨（天津）化学试剂有限公司生产，批号：20190920。生理盐水：石家庄四药有限公司生产，批号：2006192110。
1.1.2仪器
口鼻暴露吸入塔：Melton Inhalogic NIES 口鼻式吸入暴露系统，eppendorf离心机，型号centrifuge 5810R；电子天平：德国Sartorius公司生产，型号；BSA3202S-CW型；显微镜及图像分析系统：日本olympus公司生产，型号；BX51；雾化器：PARI Turbo BOY N雾化器；CEL-712 Microdust Pro监测仪；Spraytec实时喷雾粒度分析仪，英国马尔文公司。
1.2方法
将CEL-712 Microdust Pro监测仪插入到Melton Inhalogic NIES口鼻式吸入暴露系统的暴露孔，对雾化气溶胶进行浓度进行监测。Wistar大鼠，170 ~190g，雄性，适应性喂养5天，开始试验。在雾化器中装入4 mg/mL的LPS溶液，口鼻暴露系统与雾化装置连接，雾化吸入给与大鼠LPS溶液(LPS雾化中位粒径3um左右)15 min进行造模，每次雾化药液体积约为5mL，连续三天，第四天早上即第三次造模后16 h各组进行取材。
样本采集：造模后16 h用10%的水合氯醛麻醉（0.35 mL/100g），腹主动脉采血，暴露胸腔，右叶结扎，用生理盐水灌洗左肺，缓缓打入，静止平衡30 s，缓缓抽出，1 mL/次，灌洗2次，灌洗速度2 mL/min（30 s/次），合并灌洗液（回收率＞60%）。Wright-Giemsa染色法观察肺泡灌洗液中炎症细胞（巨噬细胞、中性粒细胞）含量。右肺用4%甲醛固定，室温保存，待进一步病理检测，制备石蜡切片供组织学检查。
观察指标：①肺组织病理形态学检查：将肺组织进行包埋、切片以及HE染色制备成肺组织病理切片，在光学显微镜下进行观察，进行肺组织病理损伤评分。②肺泡灌洗液中性粒细胞计数：肺泡灌洗液离心，将重悬后的肺泡灌洗液稀释，制成均匀的细胞悬液，取10 µL加至细胞计数板上，静止3 min，待细胞完全沉淀后，在低倍镜下数四角中10个小方格的细胞数，记为N。有核细胞总数=（N/4）*10*20*106/L，计算肺泡灌洗液中白细胞总数。将离心后的细胞沉淀用生理盐水重悬，沉淀混匀后，吸取10 µL细胞悬液涂片，待涂片风干后，至无水乙醇中固定10 min晾干，进行瑞氏-吉姆萨染色，于显微镜（油镜）下计数100个细胞，计算中性粒细胞所占百分比，再乘以白细胞总数计算肺泡灌洗液中性粒细胞量。③炎性因子检测：监测肺组织中的IL-1β、IL-6以及TNF-α含量。
研究背景
1.目的
采用雾化吸入脂多糖（LPS）以肺灌洗液白细胞计数、肺组织炎性因子以及肺组织的病理学改变为模型评价指标优化LPS诱导的大鼠急性肺炎模型。
2. 意义
脂多糖（LPS）常作为急性肺损伤的诱导剂，也是目前公认的诱导动物急性肺炎模型的药物。研究采用雾化吸入的方法成功建立急性肺炎模型，相对于目前常用的腹腔注射、尾静脉注射、气管注射和气管滴注等方法该建模方法具有全身副作用轻，成模率高，肺部病变均匀，重复性好的作用特点，为肺炎发病机制研究以及发病早期诊断等提供一定的实验依据。
3.国内外研究进展
脂多糖（LPS）是革兰阴性细菌细胞壁的组成部分，可诱使炎症因子的释放[1][2]，常作为急性肺损伤的诱导剂，也是目前公认的诱导动物急性肺炎模型的药物[3][4]。已有研究表明脂多糖LPS进入机体后，可以激活相关炎症信号通路[5]，导致炎症联级反应[6]，从而促进炎症因子的释放，如TNF-α、IL-1β、IL-6等均在ALI/ARDS病程进展中有非常重要的作用[7]。目前动物主要选择啮齿类动物：大小鼠。而构建模型中LPS诱导剂的给药途径和剂量差异较大。造模方法包括腹腔注射给药、尾静脉全身给药法[8-10]和气管滴注、气管注射[11、12]以及气管吸入[13、14]、滴鼻法[15-17]等气管局部给药法。不同给药方式有不同的优缺点。全身给药操作方法较为简单，但往往会引起全身炎症，且血中炎症细胞及炎症因子不能很好地反映肺部受损的严重程度[8、10]；气管内注射法可准确的控制给药剂量，但其切口可能会被微生物感染而出现炎症，影响实验结果；经口气管内给药法无伤口，但对操作要求较高，需准确找到声门，同时可能药物会仅作用在某一叶肺叶，不能造成全肺感染［18］；口咽吸入法和滴鼻法操作较简单，但进入下呼吸道的LPS 溶液量不可控，可能使实验结果产生较大变异［19］，雾化吸入法是通过自主呼吸给药，操作简单，成模率高，有很好的重复性，最接近肺炎发病的过程，在造模中具有一定的优势[20]。
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模型信息
中文名称:雾化吸入LPS致肺炎大鼠模型
英文名称:Pneumonia rat model induced by aerosol inhalation of LPS
类型:肺炎动物模型
分级:C级
用途:为肺炎发病机制研究以及发病早期诊断等提供一定的实验依据。
研制单位:中国中医科学院中药研究所
保存单位:中国中医科学院中药研究所
