雾化吸入辣椒素致豚鼠咳嗽模型

1.评价指标体系

该模型是化学刺激诱导的豚鼠咳嗽模型，咳嗽次数和咳嗽潜伏期是主要的评价指标。

2. 国内外现有模型的异同

该模型是化学诱导的豚鼠咳嗽模型，相比于现有模型在造模方法基本一致，以辣椒素吸入诱导豚鼠咳嗽，不同点在与对于咳嗽的计数方法，目前现有的咳嗽计数方法主要是通过豚鼠咳嗽时候的状态结合咳嗽时豚鼠出现的声音判断咳嗽，具有较大的主观性而且对于细小的咳嗽不易察觉。本实验通过全身体积描记系统记录的豚鼠呼吸波形，表征咳嗽波形图，通过出现典型的咳嗽波形图判断咳嗽，记录较客观，同时对于一些细小的咳嗽也可以通过波形图判断和记录。

3. 技术难点

（1）通过呼吸波，滤过干扰波形，找出典型的咳嗽的波形图。

（2）辣椒素的浓度摸索。因豚鼠对辣椒素极敏感，且安全窗较窄，极易出现因辣椒素刺激造成的呼吸困难甚至死亡，本研究前期进行了不同浓度的辣椒素雾化探索，最终选择10-4mol/L辣椒素作为造模浓度，建立稳定可靠的豚鼠咳嗽模型。

4. 创新性

使用WBP肺功能检测系统准确描记豚鼠在腔体内因咳嗽产生的剧烈呼气气流变化，通过豚鼠咳嗽呼吸波形变化科学的记录豚鼠咳嗽次数。使咳嗽的判断和技术客观，准确。

5. 应用价值

采用定量雾化辣椒素法，建立豚鼠咳嗽模型，通过WBP体积描记系统监测豚鼠咳嗽波形变化，记录咳嗽潜伏期及咳嗽次数。相较于人工观察并结合动物咳嗽声音记录咳嗽的方法，本研究方法更加科学，客观，是对现有咳嗽模型较好的优化和提升。因此，该模型为镇咳药物的筛选、药效评价及可能的机制探索提供了一个稳定可靠的动物模型。

实验动物采用SPF级豚鼠，动物饲养于中国中医科学院中药研究所和平里园区实验动物房，屏障系统豚鼠房饲养，实验设施许可证SYXK（京）2019-0003。饲养期间给予动物标准饲料和洁净饮水。本动物实验遵守国际实验动物伦理学要求。

除前面采用咳嗽次数及咳嗽潜伏期作为评价指标，本实验采用右美沙芬作为阳性对照药WBP肺功能检测系统对豚鼠咳嗽波形进行监测，可实时描记豚鼠咳嗽波形图，。

1实验材料1.1实验动物

Hartley豚鼠60只，SPF级，雌雄各半，体重260~300 g，动物合格证号：No.110011221101387556。考虑到运输过程对动物体重的影响，到达动物的体重在±10%范围内的豚鼠全部接收，一并进行检疫和适应。

1.2实验材料

1.2实验试剂

辣椒素：北京索莱宝科技有限公司；无水乙醇：北京化工厂；吐温80：北京化工厂。

1.3 实验仪器

全身体积描记系统Buxco Finepointe Whole Body Plethysmograph 4-Site System (WBP) ；美国DSI公司生产。

1.4 饲养管理

实验地点：动物饲养于中国中医科学院中药研究所和平里园区实验动物房，屏障系统豚鼠房饲养，实验设施许可证SYXK（京）2019-0003。

饲养环境：温度：20~26℃，相对湿度：40～70%；换气次数：≥15次/h；照明时间：人工光照12 h明暗周期；清扫与消毒：每日清扫动物房内环境的地面和门，每周定期采用84消毒液或过氧乙酸进行擦拭消毒。

笼具：聚丙烯豚鼠饲养盒，上附金属格栅盖。每盒饲养5只豚鼠。消毒与更换：每周2次更换饲养盒，每月更换金属格栅盖，采用山东新华医疗器械股份有限公生产的XG1-I型脉动真空灭菌器对饲养盒和金属格栅盖进行灭菌消毒。

饲料：SPF豚鼠生长繁殖饲料，购自北京科澳协力饲料有限公司提供。

垫料：软木刨花，每周2次更换垫料（与动物盒更换同时进行）。换下来的含有粪便尿液的垫料由与中药所签订合同的生物废物处理公司处理。

饮用水：实验动物饮用水，易神州（北京）科技有限公司生产的RO-300型反渗透制水机制得；置于500 mL聚丙烯水瓶中，插在饲养盒水瓶孔中，动物可自由摄取。每周3次更换水瓶，水瓶用山东新华医疗器械股份有限公生产的XG1-I型脉动真空灭菌器进行灭菌消毒。

动物尸体处理：实验过程中剖杀的动物的尸体，用包装袋妥善包装，放入-20℃冰柜保存，交由签订合同的生物废物处理机构处理。

2实验方法2.1分组及实验

Hartley豚鼠50只，雌雄各半。按体重随机分5组，每组10只：模型组、阳性对照组（右美沙芬20 mg/kg）、受试物低、高剂量组（30 、60 mg/kg）、雾化受试物组（40 mg/kg）。按5 mL/kg剂量灌胃给药，阳性对照组灌胃给予氢溴酸右美沙芬溶液，受试物低、高剂量组灌胃给予相应体积的药液，雾化受试物组雾化给药30 min，每天1次，连续3 d。模型组不处理。

2.2 咳嗽模型

按预定的时间点以0.15 mL/min的速率雾化10-4mol/L辣椒素刺激2min，由全身体积描记系统记录豚鼠咳嗽潜伏期T（s）及雾化开始12min内咳嗽次数Ct（次）。

3数据分析

实验结果以均数±标准误（Mean ± SEM）表示，采用SPSS 25.0进行统计分析，P < 0.05为产生统计学差异。

4实验结果

结果显示全身体积描记系统记录的豚鼠咳嗽波形图，呼吸波形中出现明显气流波动，与前后呼吸波形成强烈对比，示意豚鼠咳嗽一次，如图2所示。

与模型组比较，阳性对照组豚鼠咳嗽潜伏期及咳嗽次数均显著减少，结果具有显著性差异（P<0.01和P<0.01），受试物高剂量组及雾化受试物组可显著降低模型豚鼠咳嗽次数（P<0.05和P<0.05），结果见表2，图2。

表 2受试物对辣椒素致咳豚鼠的影响（x ̅±s, n=10）

注：与模型组比较*P<0.05，**P<0.01。

图2 各组豚鼠咳嗽出现了明显的呼吸波的变化

1实验材料1.1实验动物

Hartley豚鼠60只，SPF级，雌雄各半，体重260~300 g，动物合格证号：No.110011221101387556。

1.2实验材料实验试剂

辣椒素：北京索莱宝科技有限公司，批号：423G021；无水乙醇：北京化工厂，批号：20210617；吐温80：北京化工厂，批号：20210301。

1.3实验仪器

全身体积描记系统Buxco Finepointe Whole Body Plethysmograph 4-Site System (WBP) ；美国DSI公司生产。

2实验方法 Hartley豚鼠，进入全身体积描记系统软件系统，设置好参数，将动物放置于腔体内，按预定的时间点以0.15 mL/min的速率雾化10-4mol/L辣椒素刺激2min，由全身体积描记系统记录豚鼠咳嗽潜伏期T（s）及雾化开始12min内咳嗽次数Ct（次）。3数据分析

实验结果以均数±标准误（Mean ± SEM）表示，采用SPSS 25.0进行统计分析，P< 0.05为产生统计学差异。

图1全身体积描记装置

咳嗽波形图2：10-4mol/L组吸入辣椒素后期呼吸波出现了典型的变化

1. 目的

采用WBP肺功能检测系统监测腔内豚鼠因咳嗽产生的高速呼气气流造成腔内气流变化，准确描记豚鼠咳嗽行为，记录雾化辣椒素诱发豚鼠咳嗽次数，构建稳定客观的记录咳嗽次数的豚鼠咳嗽模型。用于镇咳药物的筛选、药效评价研究及其可能的作用机制探索。为研究人类咳嗽提供依据。

2. 意义

采用化学刺激诱导的豚鼠的咳嗽模型是研究咳嗽常用的动物模型，然而目前对于模型咳嗽的判断主要是基于动物形态以及声音，其主观性比较大而且对细小的咳嗽难以发现和计数。我们采用WBP肺功能检测系统监测腔内豚鼠因咳嗽产生的呼气气流造成腔内气流变化，准确描记豚鼠咳嗽行为，对诱导的咳嗽进行计数，使之客观化和准确化。本研究采用定量雾化辣椒素诱导的豚鼠咳嗽模型，应用体积描记法监测豚鼠咳嗽波形变化，计数咳嗽发生时间和次数，构建稳定的咳嗽模型，是是对于化学诱导豚鼠咳嗽模型的优化和提升。

3. 国内外研究进展

目前国内外文献中报道目前已有的咳嗽模型均以少数经典，具有代表性的动物模型为主，在造模方法上包括机械化、化学和电刺激等方法刺激动物的神经和感受器，引发咳嗽。其中机械刺激法常采用聚乙烯管或者小鬃毛插入麻醉动物喉部或者气管内进行机械刺激，引发剧烈咳嗽，但是机械刺激法动物必须在麻醉情况下进行试验[1]，且刺激强度无法控制，误差较大使模型的应用受限。化学刺激法多采用化学物质刺激呼吸系统引发咳嗽，目前常用氨水、二氧化硫、枸橼酸、辣椒素等刺激性物质，气雾吸入或者采用直接注入呼吸道的方法，刺激呼吸道感受器，诱发咳嗽。咳嗽模型采用的动物包括小鼠、大鼠、猫和犬。如YiKuang等将小鼠置于1000mL玻璃罐中，暴露于2mL的25%氨水中，人工记录小鼠咳嗽潜伏期及咳嗽次数[2]。AdesolaA等采用欧姆龙雾化器雾化柠檬酸法，诱导豚鼠咳嗽，记录豚鼠咳嗽次数[3]。李沛波等采用电刺激法采用一定频率和强度的电流刺激猫的喉上神经、气管粘膜或者胸膜等部位引咳[4]。其中采用化学吸入刺激法诱导的豚鼠是目前较为常用的模型。

目前已有的咳嗽模型咳嗽的计数多采用人工计数法，主要通过动物形态结合动物咳嗽声音等判断咳嗽的发生，人为因素较大，而且对于一些细小的咳嗽难易发现和计数，影响模型客观性和可靠性，如何准确计数咳嗽是咳嗽模型需要解决和提升的问题。

参考文献：

[1]Wei W, Gao X, Zhao L, Zhuang J, Jiao Y, Xu F. Liquiritin apioside attenuates laryngeal chemoreflex but not mechanoreflex in rat pups. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 2020 Jan 1;318(1):L89-L97.

[2]Kuang Y, Li B, Fan J, Qiao X, Ye M. Antitussive and expectorant activities of licorice and its major compounds. Bioorg Med Chem. 2018 Jan 1;26(1):278-284.

[3]Adejayan AA, Ozolua RI, Uwaya DO, Eze GI, Ezike AC. Evaluation of the anti- asthmatic and antitussive potentials of methanol leaf extract of Napoleona vogelii in rodents. Biomed Pharmacother. 2019 Jan;109:120-126.

[4]李沛波,苏畅,毕福均,王永刚,彭维,苏薇薇.化州柚提取物止咳作用及其机制的研究[J].中草药,2008(02):247-250.