免疫共沉淀

免疫共沉淀注意的问题

(1)确保共沉淀的蛋白是由所加入的抗体沉淀得到的，而并非外源非特异蛋白，单克隆抗体的使用有助于避免污染的发生。

(2) 要确保抗体的特异性，即在不表达抗原的细胞溶解物中添加抗体后不会引起共沉淀。

(3) 确定蛋白间的相互作用是发生在细胞中，而不是由于细胞的溶解才发生的，这需要进行蛋白质的定位来确定。

注意的问题：

(1)细胞裂解采用温和的裂解条件，不能破坏细胞内存在的所有蛋白质-蛋白质相互作用，多采用非离子变性剂(NP40或Triton X-100)。每种细胞的裂解条件是不一样的，通过经验确定。不能用高浓度的变性剂(0.2%SDS)，细胞裂解液中要加各种酶抑制剂，如商品化的cocktailer。

(2)使用明确的抗体，可以将几种抗体共同使用。

(3)使用对照抗体：

单克隆抗体：正常小鼠的IgG或另一类单抗

兔多克隆抗体：正常兔IgG

免疫共沉淀实验流程

(1)转染后24-48 h 可收获细胞，加入适量细胞裂解缓冲液(含蛋白免疫共沉淀酶抑制剂)，冰上裂解30min, 细胞裂解液于4°C， 转速离心30 min后取上清。

(2)取少量裂解液以备Western blot分析，剩余裂解液加1μg相应的抗体加入到细胞裂解液，4°C缓慢摇晃孵育过夜。

(3)取10 μl protein A 琼脂糖珠，用适量裂解缓冲液洗3 次，每次3 000 rpm离心3 min。

(4)将预处理过的10 μl protein A 琼脂糖珠加入到和抗体孵育过夜的细胞裂解液中4°C缓慢摇晃孵育2-4h，使抗体与protein A琼脂糖珠偶连。

(5)免疫沉淀反应后，在4°C 以3 000 rpm 速度离心3 min，将琼脂糖珠离心至管底;将上清小心吸去，琼脂糖珠用1 ml 裂解缓冲液洗3~4次;最后加入15 μl 的2×SDS 上样缓冲液，沸水煮5分钟。

(6)SDS-PAGE， Western blotting或质谱仪分析。

免疫共沉淀缺点

(1)可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质-蛋白质相互作用;

(2)两种蛋白质的结合可能不是直接结合，而可能有第三者在中间起桥梁作用;

(3)必须在实验前预测目的蛋白是什么，以选择最后检测的抗体，所以，若预测不正确，实验就得不到结果，方法本身具有冒险性。

免疫共沉淀优点

(1)相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的，处于天然状态;

(2)蛋白的相互作用是在自然状态下进行的，可以避免人为的影响;

(3)可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物。