颞叶癫痫食蟹猴海人酸模型

在第3次和第4次KA诱导后的前两天的监控录像中我们观察到，食蟹猕猴表现出由左侧前肢开始的自发性痉挛，接着是直立和平衡丧失，每天跌倒约5~10次。但是在慢性期没有观察到这样的现象。

在食蟹猕猴最后一次接受KA注射后的三个月里，连续4周以每周一次的频率记录持续60分钟的EEG脑电。如图所示，在的脑电结果中我们观察到了大量位于颞叶棘波（15~90次/30 min）。95%的棘波出现在右侧颞叶，在左侧颞叶也检测到同步的棘波。

EEG脑电显示，每次发作会有持续10~15秒的高频同步放电活动，猴子也表现出凝视和刻板样行为。随后，猴子出现缓慢转头和舔唇动作。在慢性癫痫阶段的EEG脑电图记录中，我们没有监测到全身性阵挛性发作或运动症状。这种表现与颞叶癫痫的临床表现一致，因为在颞叶癫痫患者中也很少出现全身性阵挛性发作。

为了评估颞叶癫痫模型的建模效果，我们对处于慢性癫痫期的猴子进行了长期连续的视频记录。与预期一致，在注射KA后的 3~6个月，在任何猴子身上都没有发现明显的惊厥发作。这与之前的报道一致，该研究发现在自发性癫痫的慢性阶段，接受颞叶癫痫造模处理的猕猴没有表现出明显的惊厥发作。

创新性

以往的非人灵长类颞叶癫痫模型均为恒河猴模型，食蟹猴相比于恒河猴具有体积小、便于实验操作的优点。

动物模型的制备和应用实验在具备相应资质的实验室开展。动物模型的制备、应用过程中的监督管理、处置措施、对环境和生态影响等应符合国家相关法律规定。

1. KA注射后诱导急性癫痫发作

KA注射后约30 min，食蟹猴开始从麻醉中苏醒，开始出现分泌唾液，呼吸加快，单个肢体不自主抽搐进而演变成双侧肢体不自主抽搐，全身性强直-阵挛性抽搐。发作约60 min后在没有抗癫痫治疗的情况下恢复正常。

2. 病理验证

如果对急性癫痫发作后死亡的食蟹猴进行大脑病理解剖，经过苏木素染色后的病理结果显示，注射位点位于海马齿状回区域，海马CA3区域锥体神经元发生神经元核固缩，存在大量死亡的现象。

3. KA注射前后的脑电记录验证（图示见“有助于动物模型鉴定和评价的其它材料”）

注射前脑电以慢波（θ波）为主，无明显尖波和棘波（图 2A）。

急性期癫痫样尖波首先在注射侧颞叶出现，随后扩散至前额叶（图 2B）。脑电记录中可观察到5-9Hz高波幅节律性癫痫样尖波。约10min后食蟹猴进入状态性癫痫发作，脑电中观察到双侧对称爆发性10-14 Hz节律性尖波（图 2D）以及出现肌电干扰（图 2C），食蟹猴表现出肢体颤动。状态性癫痫发作过程维持约60 min。注射生理盐水组食蟹猴在注射前后脑电信号没有显著变化。

4. KA注射3个月后的脑电验证（图示见“有助于动物模型鉴定和评价的其它材料”）

该模型在KA注射后具有自发性的癫痫异常放电。在KA注射后3个月，麻醉后通过脑电记录，可检测到整个大脑的尖波异常放电。证实模型建立成果，具有癫痫发作慢性期的自发性异常尖波放电。如果没有检测到慢性期的异常脑电，说明建模不成功，原因可能是KA诱导的急性癫痫发作程度不够，导致初始的海马损伤不够强烈。

5. 公开发表的论文依据

本模型建立的相关工作发表于国际研究期刊：Chen T, et al. A cynomolgus monkey model of temporal lobe epilepsy.Brain Research Bulletin, 2019, 144(187-193).

实验材料

8-10岁食蟹猴雌性四只，雄性2只，4ug/ul/kg KA工作液，3%的戊巴比妥钠溶液，3% H2O2，75%医用酒精，医用消毒脱脂棉，医用消毒棉签，手术器械，手术缝合线，非人灵长类动物立体定位注射仪，医用小动物打孔器，电动理发机，一次性医用注射器，微量注射玻璃针，非人灵长类动物固定架。

实验环境

屏障环境，非人灵长类实验动物专用手术间。

实验方法

1. 食蟹猴麻醉，一次性医用注射器静脉注射3%的戊巴比妥钠溶液（1 kg/ml），食蟹猴深度麻醉后（颞子轻轻夹脚趾无反应，呼吸均匀）转移到非人灵长类动物立体定位注射仪上，固定头部。

2. 食蟹猴转移到非人灵长类实验动物专用手术间，食蟹猴和手术人员全身消毒。

3. 用电动理发机剪剪去食蟹猴头部毛发，暴露头皮，75%医用酒精和碘伏依次消毒皮肤3遍，用消毒后的手术刀切开右侧顶骨皮肤，位于海马正上方，切口长度约10 mm，暴露颅骨。

4. 用医用棉签蘸取3% H2O2，轻轻擦拭颅骨表面组织；医用棉签蘸取75%医用酒精擦去残留的H2O2，医用棉签擦净颅骨表面。

5. 牙科打孔器打出直径约1 mm的孔洞，到硬脑膜止。

6. 用立体定位方法定向单侧海马CA区注射海人酸（kainic acid，KA）。注射位点为食蟹猕猴右侧海马，坐标：以右侧耳蜗与中缝连线的交点为原点，向前10 mm，再向右10 mm，深度为硬脑膜下35 mm。单次KA注射量4μg/μl/kg，注射后停针10分钟。

7. 注射完毕后，收回注射针，缝合线缝合食蟹猴头顶伤口，消毒伤口附近皮肤。将注射结束后的食蟹猴转移到温暖安静的检测室中，使用非人灵长类动物固定架固定食蟹猴的四肢和头部，卡槽留有缝隙食蟹猕猴头部可以轻微转动，接下来准备脑电记录。

8. 食蟹猴脑电记录选用Open-BCI 无线脑电记录模块。脑电记录前使用75%酒精擦拭食蟹猕猴头部皮肤，以去除毛发碎屑以及油脂。采用头皮电极和对食蟹猴颞叶进行脑电记录。头皮电极使用方法：将涂抹导电膏的杯状电极别贴附于双侧额叶（P3/P4）、双侧颞叶（F3/F4），以枕叶中缝（Cz）作为参考，右前肢食指接地。为了排除心电干扰，于心前区放置一个盘状电极记录心电图。为了排除心电干扰，心前区放置一个盘状电极记录心电图。EEG采集过程中，参数分别设置为灵敏度30 μV/mm，时间常数0.3 S，滤波范围0.5~50 Hz，采样频率250 Hz。

9. 脑电记录结束后将食蟹猴放在舒适恒温的环境中使其自然苏醒，在此过程中密切观察食蟹猴的呼吸和体温，如食蟹猴有表现出不适应立即联系兽医，食蟹猴苏醒后放回原来的笼位，及时补充食物和饮水。

10. 本研究中，每只食蟹猕猴接受3~4次KA诱导，每周一次。

研究目的及意义

癫痫是最常见的神经系统疾病之一，据估计，全世界范围内约有5000万癫痫患者，每年的癫痫发生率约为240万。我国目前约有900万的癫痫患者，约占全世界癫痫患者总数的1/5.

部分性癫痫患者约占癫痫患者总数的60%，部分性癫痫是指癫痫的病灶位于大脑半球中的一个或者位于一侧大脑半球的局部区域内。颞叶癫痫是部分性癫痫的常见类型。颞叶癫痫患者中约有1/3的患者对于常见的抗癫痫药物治疗无效，这使得颞叶癫痫成了成人最难治疗的癫痫类型。对于这些患者，手术切除治疗是唯一的治疗选择。颞叶癫痫手术治疗前需要准确定位致癫组织，手术切除时更需要完整切除致癫灶。但是由于致癫组织切除不足，仍有30%左右患者出现癫痫复发。对于无法准确定位致癫组织的癫痫患者来说，手术切除并不适合他们。

非人灵长类（non-human primates, NHPs）是指除了人类以外，其他所有灵长类动物的总称，包括11科51属，近400种动物。NHPs可分为新世界猴和旧世界猴。新世界猴包括狨猴属（Marmosets）的普通狨猴（common Marmosets）等，具有对结核病存在抵抗力，不易携带B病毒，无颊囊等特点。旧世界猴包括弥猴属（macaque）的食蟹猕猴（Macaca fascicularis）和恒河猴（rhesusmacaque）等，其特点是对结核杆菌敏感，易携带B病毒，存在大颊囊。

啮齿类实验动物在遗传上只有84%基因序列与人类相同，其生理功能和解剖结构与人类存在巨大差异，不能严格地预测药物的疗效或对人类的潜在毒性。而NHPs有超过98%基因序列与人类相同，其脾，外周血单核细胞，肝的基因组转录水平与人类的相似度分别达到了91.41%，84.36%和74.29%。这种遗传水平和生理代谢上的高度接近使NHPs成为人类疾病研究的理想模型，特别在重性脑疾病，心血管疾病和疫苗研发等重点研究领域 。

海人酸（kainic acid, KA）是L-谷氨酸的环状类似物以及离子型KA受体激动剂，最早从海藻中提取，当作杀虫剂使用。KA处理神经元可以诱导强烈的去极化作用最终导致神经元的死亡，这也是颞叶癫痫主要的病理表现。KA处理的啮齿类动物最开始具有急性期癫痫发作，随后进入4-5周的潜伏期，最终进入难治性的自发性癫痫发作阶段。KA处理的啮齿类动物会有海马硬化相关的病理表现，包括海马神经元丢失，颗粒细胞散布，苔状纤维发芽等，这与颞叶癫痫患者的病理表现接近。

使用颞叶癫痫非人灵长类海人酸模型可以更好地模拟颞叶癫痫患者地临床表现，为颞叶癫痫发病机制的研究以及抗颞叶癫痫药物的研发提供帮助。

国内外研究进展

Chen等人通过定向海马注射KA方法成功建立颞叶癫痫恒河猴模型，研究观察到了急性期的癫痫样放电，包括肢体抽搐，流涎等典型癫痫症状，但是在慢性期监测中没有观察到亚临床癫痫发作。Perez等人报道通过全身给药的方式注射匹罗卡品诱导的mTLE狨猴模型，在此模型的慢性期脑电中监测中不仅检测到了亚临床癫痫样放电还观察到了自发性癫痫发作，但是没有观察到癫痫间期放电的特征图。相比于恒河猴，食蟹猴体积小，性格温顺，容易获得，因此食蟹猴在人类疾病模型研究操作起来更加方便。