SARS-CoV-2感染恒河猴模型

更新时间：2024-11-24 来源：健明迪检测

健明迪检测提供的SARS-CoV-2感染恒河猴模型，讨论与结论目前没有确证有效的阳性药物，本单位用细胞模型从市售成药中筛选有效药物，发现PHD1（药品代号）可以在细胞水平抑制病毒复制，具有CMA，CNAS认证资质。

讨论与结论

目前没有确证有效的阳性药物，本单位用细胞模型从市售成药中筛选有效药物，发现 PHD1（药品代号）可以在细胞水平抑制病毒复制，随后用小鼠模型进行了药效学评价。发现药物治疗感染小鼠后，临床症状得到改善，病毒复制被显著抑制，肺组织病理明显改善，证明该药物可治疗感染小鼠。

制备方法

1、实验材料

1.1 攻毒毒株

毒株名称：SARS-CoV-2（原 2019-nCoV, HB-01）

毒株来源：由中国疾控中心谭文杰教授提供，新型冠状病毒的全基因组序列可以在GISAID (BetaCoV / Wuhan / IVDC-HB-01 /2020|EPI_ISL_402119)获得，存放于中国微生物数据中心（登录号 NMDC10013001，基因组登录号MDC60013002-01）。

毒株培养：将新型冠状病毒接种到 Vero 细胞进行分离和储存。Vero 细胞培养在 DMEM（英潍捷基, 美国）添加 10%胎牛血清，100 IU/ml 青霉素和 100µg/ml 链霉素的培养基中，环境为 37°C，5%CO2。新型冠状病毒的病毒滴度用标准的半数细胞感染率（a standard 50% tissue cultureinfection dose ，TCID50）进行分析。

1.2 实验动物

动物名称：恒河猴

动物级别：SPF 级

动物年龄：2-4 岁

动物体重：2.5-3.5kg

动物来源：来自中国医学科学院医学实验动物研究所

IACUC 批准号：BLL20001

2、实验操作规程

感染途径：经气管感染

感染剂量：1×106TCID50/只

感染体积：1 ml/只

3、实验结果（1）临床表现

恒河猴感染后一般状态尚可，活动下降，1#体重未发生明显变化，3#和 6#体重显著下降。3只猴感染后体温未发生明显变化。

（2）病毒核酸检测

恒河猴在感染后第 3，4，5，6，7，9，11，14 天采集鼻、咽、肛拭子进行病毒载量检测。结果显示在鼻和咽部可持续 11 天检测到大量病毒核酸（见图 4，表 1），在消化道可持续检测到病毒核酸的时间为 11 天（见 2）。其中，鼻部和咽部的病毒高峰期在第 3-6 天，消化道的病毒高峰期在第 3-7 天，消化道病毒载量低于呼吸道病毒载量，但病毒在消化道复制持续时间更长。

恒河猴感染后第 7 天，采集气管、肺、脾、肠、肝、肾、脑、心进行病毒载量检测。结果在鼻、扁桃体、下颌淋巴结、气管和左肺上叶检测到病毒核酸。

（3）病毒抗原检测恒河猴感染 7天后尸检，通过免疫组化可在肺部和小肠内检测到病毒抗原，主要分布于肺泡上皮、肠上皮，及肺肠的巨噬细胞内。

（4）病理学检查

恒河猴感染 7 天后尸检，大体病变，右肺出现深红色多灶性病变，斑块大小不一，或散在或连成一片在。

主要组织病理学改变为：肺脏血管扩张充血，肺泡隔增宽，炎细胞浸润。肺泡内巨噬细胞渗出（黑色箭头），血管周围炎细胞浸润（绿色箭头）

主要病变如下：

① 肺

左肺上叶：血管扩张充血，肺泡隔轻度增宽，肺泡内少量炎细胞渗出，少数血管周围炎细胞浸润。

左肺中叶：肺泡内少量炎细胞渗出，血管周围炎细胞浸润，血管扩张充血，

左肺下叶：肺泡内少量炎细胞渗出，血管周围少量炎细胞浸润，血管扩张充血，出血。

右肺上叶：肺泡隔轻度增宽，肺泡内少量炎细胞渗出，血管周围少量炎细胞浸润，血管扩张充血。

右肺中叶：肺泡隔轻度增宽，肺泡内少量炎细胞渗出，血管周围少量炎细胞浸润，血管扩张充血。

右肺下叶：肺泡隔增宽，肺泡内少量炎细胞渗出，血管周围炎细胞浸润，血管扩张充血。

右肺副叶：肺泡隔增宽，局部肺泡腔缩窄，肺泡内少量炎细胞渗出，血管周围炎细胞浸润，血管扩张充血。

② 其他脏器

右肾间质小灶性炎细胞浸润；鼻甲局部上皮脱落。胃粘膜炎细胞浸润。扁桃体粘膜表面可见脓性渗出物。十二指肠、回肠粘膜炎细胞浸润，上皮细胞脱落。空肠绒毛内可见寄生虫卵。唾液腺小灶性炎细胞浸润。

（5）影像学检查

感染后，隔天检测恒河猴的肺部影像学改变，第11天右肺上叶透亮度减低内可见增粗肺纹理，呈磨玻璃密度改变，水平裂可见，呈细线状。第13天右肺上叶透亮度进一步减低，肺纹理增粗，部分显示不清，水平裂不均匀增厚；左肺上叶肺条理增粗，呈磨玻璃密度改变。第15天时，右肺上叶实变，边缘模糊，内可见支气管像，水平裂增厚；左肺上叶肺条理增粗，呈磨玻璃密度改变。

（6）免疫学检测结果

恒河猴感染后第3天白细胞、淋巴细胞绝对数显著下降，淋巴细胞和单核细胞比例上升，这与临床患者表现极为接近。感染后CD3+CD8+T细胞、CD3+CD4+T细胞和单核巨噬细胞绝对数量显著下降，这种表现与临床患者极为接近，分析与病毒感染直接相关。

恒河猴感染后第 3，4，6，7，11，14 天检测血清中特异性 IgG,结果显示恒河猴产生特异性 IgG 有明显的个体差异，6#感染后第 11 天开始产生特异性 IgG.

研究背景

1 研究目的与意义

利用SARS-CoV-2感染恒河猴，观察并检测感染后的临床症状、病原学、免疫学、病理学和影像学指标，获得SARS-CoV-2感染引起肺炎发生、发展的动态数据，构建恒河猴模型，满足致病机制、疫苗和药物评价、传播途径等研究对动物模型的需求。

2 国内外研究进展

2019年底，在中国湖北武汉华南海鲜市场爆发的新型冠状病毒肺炎（COVID-19）疫情[1]，已经波及全中国及其他许多国家，被世界卫生组织定义为“国际关注的突发公共卫生事件”[2]。当务之急是要找到预防和治疗新型冠状病毒的有效措施，因此，研究新型冠状病毒在体内的致病机制迫在眉睫。构建新型冠状病毒肺炎的动物感染模型，不但为了解该疾病的致病性和病理损伤特征打下基础，也是评价相关药物和疫苗的有效性和安全性时，不可或缺的工具和科技支撑。

从临床表现来看，新型冠状病毒肺炎起病以发热为主要表现，可合并轻度干咳、乏力、呼吸不畅、腹泻等症状，流涕、咳痰等卡它症状少见。一半患者在一周后出现呼吸困难，严重者快速进展为急性呼吸窘迫综合征、脓毒症休克、难以纠正的代谢性酸中毒和出凝血功能障碍。部分患者起病症状轻微，可无发热等临床症状，多在1周后恢复。多数患者预后良好，少数患者病情危重，甚至死亡。从影像学表现来看，早期呈现多发小斑片影及间质改变，以肺外带明显。进而发展为双肺多发磨玻璃影、浸润影，严重者可出现肺实变，胸腔积液少见（图1）。

从免疫学表现来看，患者还可出现发病早期外周血白细胞总数正常或减低、淋巴细胞计数减少，部分患者出现肝酶、肌酶和肌红蛋白增高。多数患者C反应蛋白和血沉升高，降钙素原正常。严重者D-dimer二聚体升高，淋巴细胞进行性减少。从组织病理学表现来看，患者表现为间质性肺炎，肺泡腔大量的多核巨细胞和巨噬细胞浸润，肺泡比弥漫性增厚，肺泡间隔增宽（图2）。

因为新型冠状病毒（SARS-CoV-2）跟严重急性呼吸系统综合症冠状病毒severe acute respiratory syndrome coronavirus，SARS-CoV）具有高度的同源性，我们在SARS-CoV动物模型研制期间，发现恒河猴对该病毒敏感，感染病毒后，可在肺组织内复制，且宿主免疫反应和病理表现与临床相似[4]，因此选用恒河猴用于模型构建。

参考文献 :

[1]. Zhu, N.,et al., A Novel Coronavirus from Patients withPneumonia in China, 2019.New England Journal of Medicine, 2020.

[2]. Wang, C., et al., A novel coronavirus outbreak of global healthconcern. The Lancet, 2020.

[3]. Lu, R., et al., Genomic characterisation and epidemiology of 2019 novelcoronavirus: implications forvirus origins and receptor binding. The Lancet, 2020.

[4]. Qin C, et al.,Ananimal model of SARS producedby infection of Macacamulatta with SARS coronavirus.J Pathol. 2005 Jul;206(3):251-9.