尾部悬吊模拟失重诱导大鼠学习记忆障碍模型

1 评价标准

（1） 行为学评价：

① 奖励性条件反射实验

鼻触次数：动物经过训练后形成信号灯亮与奖赏物质之间条件反射，属于巴普洛夫经典条件反射范畴，反映了学习、理解、推理等方面的认知功能。造模成功动物鼻触次数显著降低。

② 水迷宫实验

逃避潜伏期和总游程：定航能力评价指标，反映动物空间参考记忆。造模成功动物逃避潜伏期和总游程显著增加。

穿台次数及目标象限游程：探索能力的评价指标，反映动物空间参考记忆。造模成功动物穿台次数及目标象限游程显著降低。

③穿梭实验

主动穿梭次数、被动穿梭次数、安全区时间：反映动物联想学习记忆能力。模型动物主动穿梭次数和安全区时间显著性降低。

（2）分子生物学评价：

①HPA轴相关指标检测

皮质酮、ACTH两种激素水平：皮质酮和ACTH是由HPA轴释放的激素，其水平高低反映HPA轴的功能。模型动物皮质酮、ACTH两种激素水平显著高于正常动物，显示出HPA轴的亢进。

② 蛋白表达检测结果

CREB和BDNF蛋白表达量：与神经元细胞的生长和发育及突触可塑性密切相关。模拟失重组动物海马CREB和BDNF蛋白表达量降低，显示其海马依赖性学习记忆的损伤。

2 技术难点

（1）寻找适当角度并选择正确的绑尾方式，保证造模成功的同时尽可能降低对动物机体的损伤。

（2） 建立无人实时监控装置，降低动物的尾吊状态未知性，以及时纠正脱落或体态改变的动物。

3 总结

经过两周以上的尾部悬吊可诱导大鼠（Wistar大鼠、SD大鼠）学习记忆障碍，可作为特因环境下失重模拟诱导学习记忆障碍的方法。与其他应激方式不同，尾部悬吊针对于航天特因环境下的应激，并很好地模拟了失重效应。通过尾部悬吊的方式建立模拟失重记忆障碍模型，发挥地面模拟实验的重要作用，为航天特因环境下，学习记忆障碍机理研究、防护和药物研究提供客观稳定的动物模型，为航天任务顺利进行提供科技支撑。

本实验采用健康成年SPF级大鼠。饲料垫料均为高压灭菌产品，购自北京维通利华实验动物有限公司，动物用水均经过除菌处理。实验动物以完整的包装直接进入实验室，观察适应5天后无异常情况，方进行实验。实验过程中动物操作均符合动物伦理学规范，对环境和生态影响等符合国家相关法律规定。

1 实验材料

（1）药品与试剂：

CORT Elisa试剂盒，ACTH Elisa 试剂盒，均购自美国Rapid BioLab公司。CREB(48H2) rabbit mAb（Cell Signaling）、PCREB (ser133) Antibody（Cell Signaling）、BDNF Antibody (N-20):sc-546（Santa Cruz Bio-technology）、Peroxidase-conjugated goat(anti-mouse)（北京普利莱生物技术有限公司）、Peroxidase-conjugatedgoat(anti -rabbit)Mouse anti-GAPDH antibody（北京中杉金桥生物技术有限公司）、Prestained Protein Ladder(40-300 kDa)（北京中杉金桥生物技术有限公司）

（2）仪器：

①行为学检测：大鼠水迷宫实时检测系统、奖励性条件反射测试系统(均由北京鑫海华仪公司、中国航天员科研训练中心和中国医学科学院药用植物研究所联合研制)

②分子生物学检测：电热恒温水浴锅（上海医疗器械五厂）、离心机（德国Eppendorf公司）、全自动酶标仪（美国Bio-Rad公司）、制冰机（意大利Icematic公司）、电热恒温培养箱（上海一恒科学仪器有限公司）、超声细胞破碎仪（美国Sonics公司）、TS-1脱色摇床（江苏海门其林贝乐公司）、双垂直板电泳槽（美国Bio-Rad公司）、Gel Doc XR凝胶成像（美国Bio-Rad公司）、移液枪（德国Eppendorf公司）、分析天平（梅特勒托利多公司）。

2 评价方法

（1）行为学评价:

①奖励性条件反射实验:

利用奖励性条件反射测试系统，对造模实验动物进行检测。应用自由适应模式，此模式为信号灯亮，奖赏物质给出。以动物探头次数（NP）为评价指标。动物探头喝水反应了动物对饮水盒的位置记忆与探索兴趣程度，此阶段训练的目的使动物得到奖赏物质可在饮水盒内获得的信息；使动物将信号灯亮与奖赏物质之间形成经典条件反射。

②水迷宫实验

空间定航实验:实验期间，保持水温在（23～25）℃，实验室物品及人员位置固定作为大鼠空间参照物。大鼠先放在位于第三象限内的平台上适应15 s，然后分别从第一、二两个象限放入迷宫中，每次实验时间为90 s，后适应15 s。训练动物找到藏于水面的平台并爬上平台。将动物入水到寻台成功所需时间记作潜伏期。寻台失败潜伏期与实验设定时间相同。用潜伏期评价动物空间定位学习能力。

空间探索实验:定位航行实验结束次日，拆除平台，选择第一象限作为入水象限，通过动物在90 s内穿过原平台位置的次数、原平台象限游程比率及时间比率（即动物在原平台象限的游程及时间占总游程及总时间的比率）来评价动物的空间记忆能力。

（2）分子生物学检测

①HPA轴相关指标检测

ELISA试剂盒法。按照试剂盒说明书进行操作，操作步骤如下：试剂盒平衡至室温（20-25℃）：拿出包被一抗的96孔酶标板,并稀释洗涤液：加入25μL血清标本与相应反应孔中；每空加入200μL酶联五，室温下反应60min；甩尽反应液，用洗涤液洗板5次；每孔加入显色液200uL，37℃下反应15min；每孔加入终止液100L：15min内用酶标仪测定450nm处波长的吸光度值。用半对数做图法绘制标准曲线,由此计算血清中激素浓度。灵敏度：ACTH2.5pg/ml，皮质酮0.7nmol/L，批件差10%-15%。

② 蛋白含量检测

（a）组织蛋白的提取

每组各3个海马组织，称重，每10mg组织加入100 μl预冷的裂解液；冰上超声破碎，制成10%组织匀浆。再置冰上裂解30 min：将组织匀浆液转移到1.5ml离心管，4℃离心（20min，12000 rpm/min）；取上清液，用BCA法测定蛋白浓度；加4x上样缓冲液，沸水浴变性5min，快速冷却，分装，－80℃冻存备用。

（b）SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳

配制分离胶。将分离胶注入垂直放置的玻璃板缝隙中，顶层加入1cm高度的异丙醇覆盖胶面。室温静置至凝胶与异丙醇之间有一水平的清晰界面，倒掉异丙醇，用滤纸凝胶顶部液体。CREB选用10%的分离胶，BDNF均选用12%的分离胶。

配制浓缩胶。将配好的浓缩胶注入玻璃板问隙。立即插入齿梳，室温静置30 min左右。

电泳。将凝胶插入垂直电泳槽中，小心拔出梳子，加满电泳缓冲液，往梳孔中加入蛋白分子量marker（3μl/孔）和样品（8μl/孔）；电压80 V，当溴酚蓝进入分离胶后,将电压增至120V，继续电泳至溴酚蓝接近分离胶底部。关闭电源，取下凝胶，进行转膜。

（c）转膜

按照凝胶大小，剪PVDF膜和两张Bio-RAD专用滤纸，将剪好的滤纸，海绵垫和夹子在电转移缓冲液中浸泡20min。PVDF膜用甲醇浸泡5min：在转膜夹中，从负极（黑色）到正极（白色）依次排放：海绵垫—滤纸—凝胶—PVDF膜—滤纸—海绵垫，盖好正极板，插入电转移槽，倒入电转移液，盖上盖；冰浴电转，350mA, 1h。

（d）封闭及抗原抗体反应

封闭。电转完毕后，将PVDF膜放入含5%脱脂奶粉的TBST中，室温轻摇1h。

孵育一抗。将PVDF膜封入自封袋中，加入一抗稀释液，将膜完全覆盖，赶出气泡，4℃过夜。一抗杂交后用10%TBST洗10 min，每次温振摇，共3次。

孵育二抗。洗涤后，将PVDF膜封入自封袋中，加入一抗稀释液，将膜完全覆盖，赶出气泡，室温孵育1h。二抗杂交后用10%TBST洗涤10 min，每次室温振摇，共３次。

（e）显色

将A液和B液按1：1比例混匀配制化学发光液，避光保存；将膜放于剪好的自封袋中，均匀滴加发光液，暗处放置3min；置于凝胶电泳显色仪中照相。

3 评价结果

（1）行为学结果

①奖励性条件反射实验

造模14天后从第1天起，与正常组相比，尾吊组鼻触次数减少（P＜0.05），尾平组在第2天与正常组形成差异（P＜0.01），尾平组与尾吊组在第3天差异出现显著性（P＜0.01）；28天时，与正常组和尾平组相比，尾吊组的鼻触次数显著性的减少（P＜0.01），尾平组与正常组间无差异。

图4 模拟失重对大鼠奖励性条射鼻触次数的影响

注：与正常组比较*P＜0.05，**P＜0.01；与尾平组比较$P＜0.05，$$P＜0.01。

②水迷宫实验

对逃避潜伏期的影响：14天时，与正常组和尾平组相比，尾吊组的逃避潜伏期明显增加，从第2天开始出现差异（P＜0.01），尾吊组与正常组无差异；28天时，尾吊组与正常组和尾平组相比，逃避潜伏期显著增加，从检测第1天起，尾吊组与正常组和尾平组一直形成显著性差异（P＜0.01），形成较稳定的显著性差异，尾平组与正常组无差异。

注：与正常组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与尾平组比较，$P＜0.05，$$P＜0.01。

对总游程的影响：14天时，尾吊组与正常组相比，总游程有明显的增加，从第3天起差异形成显著性（P＜0.01），与尾平组相比，从第3天开始出现差异（P＜0.05）并与第4、5天差异形成显著性（P＜0.01），尾平组与正常组无差异；28天时，尾吊组与正常组和尾平组相比，总游程显著增加，从第3天起差异出现显著性（P＜0.01），并形成较稳定的差异，尾平组与正常组无差异。

注：与正常组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与尾平组比较，$P＜0.05，$$P＜0.01。

同时，采用穿梭实验检测发现，尾吊动物的联想学习记忆能力降低（14天造模后），表现在主动穿梭次数、安全区时间等指标上。

（2）分子生物学检测

①HPA轴相关指标检测

与正常组相比，尾吊显著性地增加了血清中皮质酮和ACTH的含量（P＜0.01），可引起下丘脑-垂体-肾上腺皮质轴（HPA轴）功能亢进。

注：与正常组比较，**P＜0.01。

② 蛋白表达检测结果

以GAPDH为标准,与正常组相比，尾吊组CREB和BDNF的表达量显著减少（P＜0.01）。

1模拟失重实时监控装置的建立

装置由多个箱体单元组成，每一个箱体单元包括至少一个尾吊笼，尾吊笼设置在箱体单元内，用于提供动物尾部悬吊实验的空间；每一个箱体单元的上方安装有摄像装置，用于获取箱体单元中动物模拟失重尾部悬吊实验时的长期、动态、连续、实时的自发活动图像信息；每一个尾吊笼的上方安装有悬吊装置，用于与动物尾部连接；每一个尾吊笼上方安装有脱落检测装置，用于在动物尾部悬吊实验时，检测动物尾部悬吊是否脱落，且在检测到动物尾部脱落时，向计算机系统发出报警信号；以及计算机系统，用于接收摄像装置发送的图像信息和所述脱落检测装置发送的报警信号，并将报警信号发送给指定的实验人员。

与以往尾吊笼相比，此次的模拟失重装置具有以下特点：

（1）箱体单元包括至少一个尾吊笼，实现一个摄像装置同步对箱体单元中的至少一个尾吊笼中的动物的自主活动进行实时监控及图像提取，而且还可在摄像装置的镜头之前设置红外透镜，通过该红外透镜滤除其他光线的干扰，提高图像的信噪比。

（2）可通过脱落检测装置检测动物尾部悬吊是否脱落，通过计算机系统将报警信号发送给指定的实验人员，实现脱落报警，使得实验人员可及时进行实验干预。

（3）通过在尾吊笼外侧面设置双瓶饮水装置，可为动物的糖水偏爱实验检测提供条件，实现对抑郁或类抑郁行为的检测。

（4）箱体单元中的尾吊笼之间可设置活动隔板层，实现动物的交流受阻隔离状态和非隔离状态的互换。

总而言之，本装置的建立充分考虑到了动物模型多样本量、时间长、人工观察工作量大，脱落预处理不及时等因素，可实现对尾部悬吊的动物的自主活动的实时监测、脱落报警以及为抑郁或类抑郁行为检测提供条件。同时提供了路程、速度、时间三个指标，运动与静息两种状态的分时、分段、分区等数据，以及动物的尾部悬吊的状态等信息，能实时获取、保存和输出动物的实时活动图像，从而确保了实验的稳定性、可靠性。

注：11：箱体单元；12：尾吊笼；13：摄像装置；14：脱落检测装置；15：食物盒；16：双瓶饮水装置；17：发光二极管；18：活动隔板层；19：栅网；20：废物收集盒；21：多路图像卡；22：实验软件；23：接口卡；24：传输接口；31：脱落检测单元；32：消息收发单元。

2模型的诱导方法

（1）动物：SPF级，Wistar大鼠、SD大鼠（200±10 g），雄性

（2）材料：医用橡皮膏、帆布手套、伤湿止痛膏

（3）仪器：动物模拟失重尾部悬吊实时监测装置(均由北京鑫海华仪公司、中国航天员科研训练中心和中国医学科学院药用植物研究所联合研制)

（4）诱导过程：大鼠尾吊采用动物模拟失重尾部悬吊实时监测装置进行，每个箱体尺寸为26㎝×26㎝×30㎝。尾吊方法简述如下：使大鼠钻入帆布手套，仅使其尾部外露。将伤湿止痛膏剪成约长7cm，宽约1cm的长条状，将其中间段1/3长度延长轴方向对叠，两头端1/3处粘在大鼠距尾根部约1cm处，使其成一个环形结构，将医用橡皮膏螺旋形包裹在其外部，避免滑脱。将一头带钩的金属链条钩住环状膏药，另一头穿过尾吊仪微动开关的环形挂圈，根据需要调节链条长度，并用金属夹将链条固定，使动物躯干与尾吊笼底部约成-30°角，使大鼠借助前肢可在尾吊笼内360°自由活动和自由饮食饮水。行为学检测期间应保持大鼠处于造模时的尾吊状态，在行为学检测时应尽量减少动物的非尾吊时间，取下后及时检测，检测完后及时恢复尾吊。

随着我国在载人航天工程事业取得重大成功，空间站工程也正式启动。空间站工程要求航天员必须具备较长时间的连续在轨驻留能力，必须克服长时间航天飞行因受到失重、昼夜节律改变、狭小密闭环境等多种因素影响所导致的一系列诸如心血管功能障碍、失重骨丢失、肌肉萎缩、免疫功能下降等失重生理效应。同时，航天环境可造成认知功能及反应判断能力下降，直接影响航天员对信息处理可靠性，甚至造成重大操作失误，对航天工作带来的危害则难以估量［1-3］。

在受科学技术、经费等限制，航天飞行难以长期、重复进行，地面模拟失重的实验方法的建立就显得尤为重要。Darren M. Lipnicki 等分析了25例健康男性受试者在60天头低位卧床前及卧床期间（第51天）LGT的行为表现，发现卧床前及期间受试者的决策能力明显改变[4]。MesserottiBenvenuti 等将22 名男性受试者随机分为对照组及头低位卧床组，3小时后对受试者进行图片观察任务测试，结果表明头低位卧床会明显影响了受试者的学习能力[5]。使用功能性磁共振fMRI方法测试结果表明失重状态时，兴奋脑区的激活范围和强度有明显的减少[6]。吴大蔚等观察了尾部悬吊模拟微重力对小鼠学习记忆能力的影响，发现尾吊7d及12d小鼠空间记忆能力降低[7]。

实验动物在地面模拟失重的研究中得到了广泛的应用。对于动物实验，起初是采用全身或局部限动的方法模拟失重状态下的低活动度，逐渐发展到采用头低位的方法模拟失重环境下的血液头向分布生理学效应[8]。头低位尾部悬吊模拟失重应激程度较轻，可长时间模拟失重状态。该模型的研究可为航天等特因环境下，学习记忆障碍机理研究、防护和药物研究提供实验基础。

参考文献：

[1] Li S, Wang C,Wang MW, et al. Impairment of the spatial learning and memory induced bylearned helplessness and chronic mild stress[J]. Pharmacology Biochemistry andBehavior, 2006, 83(2):186-193.

[2] McTeague LM, LangPJ. The anxiety spectrum and the reflex physiology of defense: fromcircumscribed fear to broad distress[J]. Depress Anxiety, 2012, 29:264-281.

[3] Conrad CD. Acritical review of chronic stress effects on spatial learning and memory[J]. ProgrNeuro-Psychopharmacol Biol Psychiat, 2010, 34:742-755.

[4]Lipnicki, DM, Gunga, HC, Belavy, DL, dFelsenberg, D. Decision making after 50days of simulated weightlessness [J]. Brain research, 2009, 1280: 84-89.

[5] MesserottiBenvenuti, S, Bianchin, M, and Angrilli, A. Effects of simulated microgravityon brain plasticity: A startle reflex habituation study [J]. Physiology &behavior, 2011, 104:503-506.

[6] 刘刚, 金真, 李科, 曾亚伟, 李勇枝. 模拟失重状态对人脑认知功能的影响 [J]. 中华航空航天医学杂志,2005,16(3): 161-164.

[7] 吴大蔚, 沈羡云, 董颀, 等. 尾部悬吊对小鼠学习记忆的影响 [J]. 航天医学与医学工程. 2000,13(4): 244-248.

[8] 董丽, 王琼, 刘新民, 杨思进.地面模拟失重实验方法概况[J].中国实验动物学报, 2013,21(05): 90-94.