维甲酸诱导第一、二鳃弓综合征大鼠模型

该模型通过长期观察普通狼疮小鼠模型，待其到40周龄时，检测其dsDNA等，结合皮肤症状变化，来确定慢性狼疮皮肤病模型的建立。目前国际上尚欠缺类似模型，为研究狼疮皮肤病发病机制提供了工具。

模型动物饲养在武汉大学人民医院动物房SPF级动物实验室，实验动物使用许可证SYXK（鄂）2015-0027。

（1）建筑特点

门采用专用净化密闭门并配备观察窗。单向走道呈顺时针走向设计。屏障系统内共有大鼠饲养室1间，小鼠饲养室3间，隔离观察室1间，实验准备室1间，洁物存放室1间，清洗消毒室1间。此外，屏障系统外配有监控室、机房和配电室等。

（2）设计参数

室内温度：20～26°C；日温差：≤4°C；相对湿度：40%～70%；换气次数：15～20次/h；气流速度：≤0．2m/s；压强梯度：20～50Pa；空气洁净度：7级；菌落数：≤3个/皿；氨浓度：≤14mg/m3；噪声：≤60dB；Z低工作照度：≥200lx；动物照度：15～20lx；昼夜明暗交替时间：12/12h。

（3）通风和空调系统

动物实验室采用全新风中央空调通风系统。空气经过初、中、三级过滤器后进入实验室内环境。

（4）照明系统

一更、淋浴、二更、气闸、清洁走道、洁物存放处、污物走道、缓冲间和清洗消毒间、动物饲养室、实验准备间、隔离观察室和功能实验室等安装有手动和自动开关，根据实际需要，调节控制室内照明灯。未启用房间、清洁走道、洁物存放处、污物走道等在每日中午12点和晚上8点开启紫外线灯照射1h。

（5）通讯系统

因为SPF级动物实验室的环境和设施具有特殊要求，人员进入后不能随意出入，而室内外的联系又十分重要，故室内各房间均安装内部电话机，按照房间顺序编排电话号码，各室内电话可相互连通，并均与监控室总机保持联系，保证实验室内外信息的及时沟通。

（6）监控系统

对SPF级动物实验室的出入口、走道、实验动物饲养室、功能操作室等重要位置均安装了可作270°旋转的摄像机，能够及时了解设施的运行状态；也能有效督促实验人员执行科学的操作规程，避免人为因素造成室内环境和设施的污染；并对整个实验期间的动物状态和反应进行观察，减少对动物的滋扰。

（7）供水系统

SPF级实验动物饮用水以纯净水为宜。本实验室采用管道供水，将处理后的纯净水用塑胶管道输送到屏障系统内实验准备室，设置接水槽，为实验动物供应灭菌的饮用水和屏障系统内用水。要经常更换和清洗输水管道，清洗笼具的用水添加适当比例的84消毒液。

（8）供电系统、警报系统和消防设施

SPF级动物实验室要求全天候不间断供风和供电，如果出现故障，不能及时发现和处理，就可能导致环境设施的污染、动物感染或死亡，造成严重后果。因此应对SPF级动物实验室使用独立稳定的供电系统，并配备有应急电源。在中央空调机房控制室安装风机故障警报系统，以便及时检修和维护，保证设施的安全运行。

（9）消毒灭菌设备

为防止外界物品进入SPF级动物实验室时所携带的细菌污染室内环境和造成动物交叉感染，按照不同物品的特性，进行紫外线照射消毒、渡槽消毒液消毒或专用的机动门真空灭菌器消毒。

（10）动物饲养笼具

饲养大、小鼠的笼具聚碳酸脂材料的塑胶笼具，具有高透明、耐高压、耐高温、耐酸碱等特点。通用的不锈钢笼具长、宽、高分别为40、30、20cm，适用于单笼饲养有特殊要求的实验动物，配有底盘和食槽，确保实验动物有充足的采食和活动空间，同时也保证室内环境的清洁。

（11）垫料的选择和使用

在使用塑胶垫料时，垫料是大小鼠直接接触的铺垫物，起到吸湿、保暖和造窝的作用。垫料的好坏直接影响到大小鼠术后的恢复、生长发育和繁殖性能。目前，所使用的垫料主要有玉米秸垫料、刨花垫料。

（12）饲料配制

大小鼠的生产型饲料和维持型饲料必须严格按照国家标准，进行科学配制生产。每半年检测一次饲料的微生物指标和有效营养成分指标，保证饲料的质量。

（1）维甲酸干预可造成大鼠胚胎整体及第一二鳃弓衍生组织的发育不良。颅面部发育异常表现为头颅外形圆钝，耳壳较正常缩小，位置向下及向背侧移位，部分胚胎出现无耳畸形，与第一二鳃弓综合征患者颅面部症状相似。

（2）维甲酸干预对神经嵴来源软骨细胞的影响

第一二鳃弓组织形成面部的大部分骨性及软骨结构，其过程为构成第一二鳃弓的神经嵴细胞分化成软骨细胞并通过软骨化骨的过程形成面部的大部分骨性组织。前期工作中我们利用致畸物维甲酸处理神经嵴来源软骨细胞，发现维甲酸可抑制细胞的增殖及相关软骨标志性基因的表达，从而可能导致相关软骨及软骨来源颅面结构发育不良。利用基因芯片技术筛选出了维甲酸作用后表达改变1.5倍以上的基因，通过生物信息学分析确定多种通路参与了维甲酸导致的先天性颅面畸形的发生。

（3）本研究证实了皮下注射维甲酸的有效性及安全性

维甲酸对皮肤及全身均有一定的毒性，但如图5所示，皮下注射维甲酸对注射部位皮肤无明显影响，显示了皮下注射维甲酸的局部安全性。

1.Wistar大鼠饲养及合笼：大鼠颗粒饲料喂养，自由饮水，于晚8点将Wistar大鼠按雌雄比2:1合笼，于次日早8点检查雌鼠阴道，发现阴栓定为孕0天（G0）。当天中午定位孕0.5天（G0.5）。观察孕鼠一般生长情况，看皮毛是否光滑，精神状态是否良好，有无流产现象，随机分笼饲养。

2.皮下注射维甲酸, 利用维甲酸干预大鼠胚胎，对不同给药时间、给药剂量的相关胚胎发育整体指标及颅面部发育指标进行测量及统计。发现G10天干预对胚胎整体发育影响较小，但对颅面部发育影响较大，因此更接近于第一二鳃弓综合征病人整体及颅面部表现。鼻枕距及顶距是颅面部发育的两个重要指标，皮下注射维甲酸40㎎/㎏即造成了两个指标的明显减小，同时出现头颅外形圆钝。

第一、二鳃弓综合征是面部常见先天畸形，新生儿发生率为1/5000-1/4000，多为单侧。病因目前还不完全明确，主要为环境和遗传因素是目前小耳畸形病因研究的重点。临床表现：耳部轻度畸形或下移，重度则仅存耳部皮赘、外耳完全缺损、外耳道闭锁、中耳听骨发育不全，听力障碍或传导性耳聋。下颌骨畸形轻度表现为下颌骨升支及髁状突短小，关节窝变浅，重者整个升支消失，下颌骨体发育不全，患者面部短小等。

维甲酸是维生素A的衍生物，其生物活性是由一系列受体介导，主要为维甲酸受体（RAR）和维甲酸X受体（RXR）。维甲酸在胚胎发育中发挥重要作用，如正常的维甲酸信号对于神经嵴组织的形成和正常发育是必须额，对神经嵴发育中的重要基因也起调节作用，其中包括Hox基因，参与神经嵴组织发育的Wnt、成纤维细胞生长因子等通路也受维甲酸调节，维甲酸还参与了胚胎发育中体轴的建立。众多临床报道及基础研究均显示维甲酸可导致多种胚胎畸形，其中即包括先天性小耳畸形。据统计孕期接触维甲酸导致畸形的发生率显著高于未接触者。